注射劑包裝密封完整性檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

注射劑的無(wú)菌性直接關(guān)系患者的生命安全。注射劑在其整個(gè)生命周期內(nèi)必須符合無(wú)菌的要求并能通過(guò)無(wú)菌檢查[1-2]。但無(wú)菌檢查存在局限性，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)建議在穩(wěn)定性研究中，使用密封完整性檢測(cè)來(lái)替代無(wú)菌檢查。密封完整性檢測(cè)不但能確保注射劑的無(wú)菌，還能保障注射劑在有效期內(nèi)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。美國(guó)、歐盟、日本、澳大利亞、巴西、加拿大等國(guó)家和地區(qū)均頒布法律法規(guī)，要求注射劑包裝具有密封完整性[3]。2020年5月14日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心(CDE)發(fā)布了《化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》，規(guī)定在注射劑穩(wěn)定性考察初期和末期以外的其他時(shí)間節(jié)點(diǎn)，可以經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的密封完整性檢測(cè)代替無(wú)菌檢查。密封完整性檢測(cè)已成為注射劑穩(wěn)定性研究的重要組成部分，且成為注射劑一致性評(píng)價(jià)關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究中以“注射劑”“包裝”“密封性”“密封完整性”“sterileproduct”“parenteral”“package”“containerclosureintegrity”“l(fā)eakage”“l(fā)eak”等為關(guān)鍵詞，對(duì)PubMed、Elsevier、Springer、中國(guó)知網(wǎng)、維普、萬(wàn)方等國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的1960年1月至2020年2月期間發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行單一或組合搜索，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)752篇，其中有效文獻(xiàn)48篇?，F(xiàn)結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)注射劑包裝密封完整性檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)歸納，以期為注射劑一致性評(píng)價(jià)中密封完整性的檢測(cè)提供參考。Part1密封完整性檢測(cè)方法分類(lèi)

1.1確定性檢測(cè)方法和概率性檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)時(shí)泄漏現(xiàn)象是否可預(yù)測(cè)和可控，可將密封完整性檢測(cè)分為確定性檢測(cè)和概率性檢測(cè)。確定性檢測(cè)方法是基于系列可預(yù)見(jiàn)的泄漏現(xiàn)象，采用可控制和可監(jiān)測(cè)的理化測(cè)試技術(shù)對(duì)泄漏進(jìn)行檢測(cè)，并可得到客觀的定量檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法，常用方法有質(zhì)量提取法、真空衰減法、激光頂空氣體分析法、高壓放電法、氦質(zhì)譜法(真空模式)等。概率性檢測(cè)方法是基于系列具有不確定性、會(huì)產(chǎn)生隨機(jī)結(jié)果的測(cè)試環(huán)節(jié)的檢測(cè)方法，其檢測(cè)結(jié)果具有隨機(jī)性，常需較大樣本量和嚴(yán)格的測(cè)試條件，以降低結(jié)果的隨機(jī)性，保障結(jié)果的有效性，常用方法有氦質(zhì)譜法(嗅探模式)、微生物挑戰(zhàn)法和液體示蹤法。兩種方法各有優(yōu)劣，應(yīng)根據(jù)注射劑和包裝的特性來(lái)選擇合適的檢測(cè)方法。確定性檢測(cè)方法具有靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)優(yōu)先考慮。1.2無(wú)損檢測(cè)方法和破壞性檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)方法是否對(duì)注射劑和包裝有影響，可將密封完整性檢測(cè)分為無(wú)損檢測(cè)和破壞性檢測(cè)。無(wú)損檢測(cè)方法包括質(zhì)量提取法、真空衰減法和激光頂空氣體法。高壓放電法因?qū)ψ⑸鋭┖桶b無(wú)影響[4]，一般情況下被視為無(wú)損檢測(cè)方法。但高電壓會(huì)將包裝內(nèi)的氧氣轉(zhuǎn)化成臭氧，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量[3]。因此，《美國(guó)藥典》(USP39－1207)建議，采用高壓放電法檢測(cè)密封完整性時(shí)需評(píng)估其在整個(gè)生命周期里對(duì)藥品質(zhì)量的影響[5]。氣體示蹤法既可能是無(wú)損的，也可能是破壞性的，當(dāng)需要破壞包裝壁而引入示蹤氣體或示蹤氣體對(duì)注射劑或包裝有影響時(shí)即為破壞性檢測(cè)方法。微生物挑戰(zhàn)法和液體示蹤法對(duì)藥品或包裝有影響，屬破壞性檢測(cè)方法。無(wú)損檢測(cè)方法相對(duì)于破壞性檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)。無(wú)損檢測(cè)時(shí)，在方法建立和驗(yàn)證過(guò)程中可重復(fù)使用樣品。同時(shí)，《美國(guó)藥典》(USP39－1207)指出，采用無(wú)損檢測(cè)方法時(shí)通過(guò)密封完整性檢測(cè)某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的穩(wěn)定性樣品，還可用于該時(shí)間節(jié)點(diǎn)下其他穩(wěn)定性項(xiàng)目的檢測(cè)，如可用于包材相容性的檢測(cè)。因此，采用無(wú)損檢測(cè)方法可以節(jié)省樣品和降低檢測(cè)成本，這對(duì)樣本量較少或價(jià)格昂貴的藥品來(lái)說(shuō)尤為重要。1.3流體流轉(zhuǎn)型檢測(cè)方法和非流體流轉(zhuǎn)型檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)過(guò)程中的泄漏是否由于流體流轉(zhuǎn)產(chǎn)生，可將密封完整性檢測(cè)分為流體流轉(zhuǎn)型檢測(cè)和非流體流轉(zhuǎn)型檢測(cè)。質(zhì)量提取法、真空衰減法、激光頂空氣體分析法、氣體示蹤法、微生物挑戰(zhàn)法和液體示蹤法均屬流體流轉(zhuǎn)型檢測(cè)方法，前4種是基于氣體的流轉(zhuǎn)，后2種是基于液體的流轉(zhuǎn)?；诹黧w流轉(zhuǎn)的檢測(cè)方法，漏孔被堵塞后，流體無(wú)法順利流轉(zhuǎn)通過(guò)漏孔，可造成假陰性結(jié)果。采用基于流體流轉(zhuǎn)的檢測(cè)方法時(shí)，固體物質(zhì)均會(huì)堵塞漏孔而影響檢測(cè)結(jié)果。采用基于氣體流轉(zhuǎn)的檢測(cè)方法時(shí)，液態(tài)的蛋白質(zhì)類(lèi)藥品由于溶劑揮發(fā)易在漏孔附近集聚并堵塞漏孔。因此，前4種均不適用于液態(tài)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物包裝的檢測(cè)。采用氣體示蹤法檢測(cè)時(shí)，液體也可能堵塞漏孔。采用基于液體流轉(zhuǎn)的方法，漏孔中的氣泡可能會(huì)“堵塞”漏孔。高壓放電法屬非流體流轉(zhuǎn)型檢測(cè)方法，當(dāng)漏孔被蛋白質(zhì)類(lèi)藥物集聚體堵塞時(shí)，由于蛋白質(zhì)集聚體導(dǎo)電，故漏孔的堵塞不會(huì)影響泄漏的檢測(cè)。因此，高壓放電法能用于液態(tài)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物包裝的檢測(cè)[3]，且能與其他檢測(cè)方法形成互補(bǔ)，完善液態(tài)蛋白質(zhì)類(lèi)大分子藥物包裝密封完整性的解決方案。1.4驅(qū)動(dòng)型檢測(cè)方法和非驅(qū)動(dòng)型檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)時(shí)是否施加外力來(lái)驅(qū)動(dòng)形成泄漏，可分為驅(qū)動(dòng)型檢測(cè)和非驅(qū)動(dòng)型檢測(cè)。驅(qū)動(dòng)型檢測(cè)方法包括質(zhì)量提取法、真空衰減法、氦質(zhì)譜法(真空模式)、微生物挑戰(zhàn)法(浸沒(méi)模式)、液體示蹤法等，均需通過(guò)加壓或抽真空的方式，使包裝內(nèi)外形成壓力差來(lái)驅(qū)動(dòng)泄漏發(fā)生，以便檢測(cè)泄漏。同時(shí)，對(duì)于一些具有活動(dòng)部件的包裝(如注射器)，以及易發(fā)生形變的柔性包裝，測(cè)試時(shí)需采用特殊工具，以限制活動(dòng)部件的位移和柔性包裝的形變，從而降低檢測(cè)時(shí)的背景噪音，提高檢測(cè)靈敏度，避免檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。激光頂空氣體法和高壓放電法在測(cè)試時(shí)不需依靠外力來(lái)驅(qū)動(dòng)泄漏，屬非驅(qū)動(dòng)型檢測(cè)方法，不需特殊工具來(lái)限制部件的移動(dòng)和包裝的形變。Part2注射劑密封完整性檢測(cè)方法

2.1質(zhì)量提取法質(zhì)量提取法是采用智能分子流質(zhì)量傳感器，檢測(cè)在真空環(huán)境中從包裝泄漏出的氣體質(zhì)量流率的方法。將包裝放入測(cè)試倉(cāng)，對(duì)測(cè)試倉(cāng)進(jìn)行抽真空，包裝內(nèi)的氣體或由液體揮發(fā)生成的氣體會(huì)通過(guò)漏孔泄漏出包裝，被能在分子流狀態(tài)下工作的智能分子流質(zhì)量傳感器所檢測(cè)，最后以檢測(cè)的質(zhì)量流率來(lái)判定包裝是否泄漏。該法綜合性能強(qiáng)，競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)大。檢出限可達(dá)玻璃微量滴管名義孔徑1μm和鎢絲直徑15μm[6]，檢測(cè)靈敏度高;具有總泄漏、大泄漏、小泄漏檢測(cè)機(jī)制，檢測(cè)范圍寬;基于質(zhì)量流率檢測(cè)機(jī)制，檢測(cè)結(jié)果受外部環(huán)境如溫度、濕度的影響較小，穩(wěn)定性好;檢測(cè)的包裝類(lèi)型包括彈性體密封件或螺紋蓋密封的玻璃瓶和塑料瓶、玻璃或塑料安瓿瓶、注射器、柔性包裝袋等，包裝的容積涵蓋幾毫升到幾升，藥品的狀態(tài)包括固態(tài)和液態(tài)，幾乎覆蓋注射劑的所有包裝類(lèi)型和劑型，方法適用范圍廣。鑒于其眾多優(yōu)勢(shì)和行業(yè)內(nèi)對(duì)其的廣泛認(rèn)可，質(zhì)量提取法已經(jīng)成為注射劑一致性評(píng)價(jià)中密封完整性檢測(cè)的理想方法之一。美國(guó)材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)也已為該方法設(shè)立國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ASTMF3287)。該標(biāo)準(zhǔn)在氣體泄漏和液體泄漏兩種模式下，建立和驗(yàn)證了玻璃瓶、低密度聚乙烯瓶、玻璃注射器的密封完整性檢測(cè)方法，方法驗(yàn)證的指標(biāo)包括檢出限、準(zhǔn)確度和精密度。在頂空氣體泄漏模式下，在置信概率為95%的檢出限為玻璃微量滴管名義孔徑1μm;在液體泄漏模式下，玻璃瓶和低密度聚乙烯瓶在95%置信概率下的檢出限為玻璃微量滴管名義孔徑1μm，玻璃注射器為2μm。在檢出限及以上的漏孔檢測(cè)中，方法的準(zhǔn)確度均為100%，精密度試驗(yàn)結(jié)果滿(mǎn)足重復(fù)性限和重現(xiàn)性限的要求。注射劑的不同形態(tài)和組成對(duì)質(zhì)量提取法檢測(cè)結(jié)果的影響不同。YOON等[7]研究發(fā)現(xiàn)，注射劑為固體粉末(甘露醇粉)時(shí)，不會(huì)堵塞漏孔;注射劑為液態(tài)時(shí)，黏度對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小。當(dāng)注射劑為液態(tài)的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物且濃度較低時(shí)，漏孔不會(huì)堵塞;當(dāng)藥物濃度增大時(shí)，漏孔會(huì)被堵塞，原因是大分子蛋白質(zhì)類(lèi)藥物在漏孔附近聚集阻塞漏孔，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。2.2真空衰減法真空衰減法采用壓力傳感器檢測(cè)包裝泄漏引起測(cè)試倉(cāng)真空度的衰減值，工作原理與質(zhì)量提取法相似，具體如下，將測(cè)試包裝置入測(cè)試倉(cāng)并抽真空，包裝內(nèi)的氣體或液體揮發(fā)生產(chǎn)的氣體通過(guò)漏孔進(jìn)入測(cè)試倉(cāng)，引起倉(cāng)內(nèi)真空度變小，可使用壓力傳感器檢測(cè)真空度的衰減值，最后以衰減值來(lái)判定包裝是否泄漏。一般配合使用絕壓傳感器和差壓傳感器。絕壓傳感器用于監(jiān)測(cè)測(cè)試倉(cāng)的絕對(duì)壓力，以便控制倉(cāng)內(nèi)的真空度，使包裝內(nèi)的氣體能通過(guò)漏孔順利流轉(zhuǎn)至測(cè)試倉(cāng)，對(duì)于液體泄漏的檢測(cè)更為重要，因?yàn)楸仨殞y(cè)試倉(cāng)的真空度提高到一定程度，才能使液體氣化而溢出包裝。在預(yù)定時(shí)間內(nèi)，如果測(cè)試倉(cāng)內(nèi)的真空度不能提高到一定程度，則表明包裝有大漏存在。差壓傳感器的靈敏度更高，用于檢測(cè)從包裝流轉(zhuǎn)出的氣體引起的真空度的變化值，故用于檢測(cè)小漏。真空衰減法由于在泄漏檢測(cè)行業(yè)被廣泛使用，已為其設(shè)立國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ASTMF2338)，適用的包裝有無(wú)蓋的托盤(pán)和杯碟、多孔阻隔材料密封的托盤(pán)、無(wú)孔硬質(zhì)包裝、無(wú)孔軟包裝，其中無(wú)蓋的托盤(pán)和杯碟氣體泄漏的檢出限均為50μm，多孔阻隔材料密封的托盤(pán)氣體泄漏的檢出限為100μm，無(wú)孔硬質(zhì)包裝氣體和液體泄漏的檢出限均為5μm。該方法適用于檢測(cè)氣體泄漏和液體泄漏。WOLF等[8]研究發(fā)現(xiàn)，采用液體泄漏檢測(cè)方法對(duì)空氣和水分別填充的包裝進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)水填充的包裝在相同尺寸的漏孔下產(chǎn)生的泄漏率更大，原因是水在較高真空度下會(huì)揮發(fā)產(chǎn)生大量水氣。真空衰減法不適合頂空氣體或液體較少、且泄漏過(guò)大包裝的檢測(cè)。當(dāng)包裝內(nèi)頂空氣體或液體較少時(shí)，在真空測(cè)試倉(cāng)被抽真空時(shí)，包裝內(nèi)有限的氣體會(huì)通過(guò)大漏孔迅速溢出，隨測(cè)試倉(cāng)內(nèi)的氣體被抽走，在測(cè)試時(shí)包裝內(nèi)無(wú)氣體流轉(zhuǎn)至測(cè)試倉(cāng)而引起真空度變化，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。另外，其穩(wěn)定性不及質(zhì)量提取法。原因是前者基于壓力變化而后者基于質(zhì)量變化，壓力會(huì)隨環(huán)境溫度的波動(dòng)而變化，而質(zhì)量則不然。2.3激光頂空氣體分析法激光頂空氣體分析法通過(guò)檢測(cè)包裝內(nèi)頂空氣體對(duì)低能量激光的吸光度來(lái)檢測(cè)氣體的含量。根據(jù)檢測(cè)氣體的種類(lèi)，可調(diào)整激光的頻率，使激光的波長(zhǎng)與目標(biāo)分析氣體的吸收光譜特性相匹配[9]。當(dāng)激光通過(guò)包裝內(nèi)的頂空氣體，頂空氣體對(duì)激光有吸收，根據(jù)吸光度采用校準(zhǔn)曲線(xiàn)推導(dǎo)出目標(biāo)檢測(cè)氣體的含量，以此來(lái)判定包裝是否泄漏。目前，能檢測(cè)的氣體種類(lèi)主要有氧氣、水蒸氣和二氧化碳，另外還可用于檢測(cè)包裝內(nèi)頂空部分的壓強(qiáng)。該法的檢測(cè)靈敏度很高，檢出限能達(dá)到玻璃微量滴管名義孔徑0.2μm[10]，常能滿(mǎn)足包裝系統(tǒng)最大允許泄漏限度值的要求，在方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證中，可免除與微生物挑戰(zhàn)法或液體示蹤法的比較研究。該法的顯著特點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果能反映產(chǎn)品經(jīng)歷的生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等整個(gè)過(guò)程的泄漏情況，而其他檢測(cè)方法僅能表征包裝在測(cè)試時(shí)的密封狀態(tài)。這一特性對(duì)于評(píng)估在極端條件下保存藥品的密封完整性尤為重要，如在超低溫條件下保存的包裝內(nèi)具有特殊頂空氣體組成或壓強(qiáng)的藥品[11]。膠塞在－80℃下會(huì)喪失黏彈性，密封能力會(huì)降低，包裝會(huì)產(chǎn)生泄漏，導(dǎo)致頂空氣體的組成或壓強(qiáng)發(fā)生變化。當(dāng)把產(chǎn)品取出置于常溫后，膠塞會(huì)恢復(fù)密封性能，此時(shí)若采用其他方法則無(wú)法檢出泄漏，而采用激光頂空氣體分析法則可以有效檢測(cè)出在低溫下產(chǎn)生的泄漏。包裝內(nèi)的頂空氣體通過(guò)漏孔特別是較小的漏孔與環(huán)境的氣體交換非常慢，要想氣體交換量達(dá)到方法的檢測(cè)限，需要很長(zhǎng)的時(shí)間。為了加快檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，可采用“Bombing”程序來(lái)加速氣體交換。該程序是將樣品置于具有一定真空度的環(huán)境中放置一定時(shí)間，然后取出在大氣環(huán)境中平衡一定時(shí)間，通過(guò)增加包裝內(nèi)外的壓差來(lái)加快包裝內(nèi)外氣體的交換[12－13]。但該程序中產(chǎn)品處理的壓力和時(shí)間等參數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很大。激光頂空氣體分析法適用范圍有一定要求。首先是對(duì)包裝的透光性有要求，只有低能量激光能通過(guò)的透明或半透明的包裝才能檢測(cè)，該法已用于西林瓶[10，12，14－15]和安瓿瓶[13]等透明包裝的檢測(cè)，也可用于柔性包裝袋的檢測(cè)。其次是對(duì)包裝內(nèi)頂空氣體有要求，僅頂空氣體組成或壓強(qiáng)與所處環(huán)境不同且頂空氣體體積足夠大的藥品包裝才能檢測(cè)。對(duì)于包裝內(nèi)填充氮?dú)獾乃幤泛蛢龈芍破?，可檢測(cè)包裝內(nèi)頂空氣體中氧氣的含量[10，13，16－17];水蒸氣的檢測(cè)主要應(yīng)用在包裝內(nèi)呈負(fù)壓的藥品和凍干類(lèi)制劑的檢測(cè)[9，15，18];對(duì)于儲(chǔ)存在干冰中的藥品，可檢測(cè)包裝頂空氣體中的二氧化碳含量[3]。對(duì)于預(yù)灌注注射器，頂空氣體體積較小，一般只有幾毫升，測(cè)試時(shí)激光可能會(huì)通過(guò)液體部分而被水吸收，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤，因此該法不適用于檢測(cè)預(yù)灌注注射器密封的完整性。2.4高壓放電法高壓放電法檢測(cè)通過(guò)藥品和包裝的電流來(lái)判斷泄漏情況，適用于液態(tài)或半液態(tài)的藥品，且藥品的導(dǎo)電性要比包裝好的情形。完整的包裝導(dǎo)電性能差，通過(guò)包裝的電流較低;當(dāng)包裝中有漏孔，且藥品處于漏孔附近或填充在漏孔中時(shí)，包裝的電阻會(huì)變小，通過(guò)的電流會(huì)大幅增加。當(dāng)電流增加到一定程度，超過(guò)泄漏閾值時(shí)，表明包裝泄漏。藥品與包裝導(dǎo)電性差異越大，施加的電壓越大，藥品與漏孔的距離越近，方法的靈敏度就越高。高壓放電法對(duì)柔性包裝袋的檢出限為激光打孔名義孔徑2.5μm，檢測(cè)范圍為2.5～11.2μm[19]，同時(shí)還能檢測(cè)出熱封時(shí)產(chǎn)生的型式缺陷[20];對(duì)于預(yù)灌注注射器，檢出限可達(dá)到激光打孔5μm[21]。高壓放電法檢測(cè)速度非?？?，往往只需要幾秒鐘，因此在生產(chǎn)線(xiàn)的在線(xiàn)檢測(cè)中使用廣泛[3]。在確定性檢測(cè)方法中，高壓放電法僅能檢測(cè)漏孔位置，其通過(guò)各種機(jī)制確保電極探針能夠探測(cè)包裝表面的每個(gè)部位，探測(cè)電流最強(qiáng)部位以判斷漏孔位置。在測(cè)試柔性包裝時(shí)，采用碳刷刷毛制備的電極探針，沿不同方向掃過(guò)樣品表面，以尋找具體的漏孔位置[19]。在測(cè)試注射器時(shí)，使注射器繞其中心軸不停旋轉(zhuǎn)，而電極探針垂直于旋轉(zhuǎn)方向在注射器表面不停移動(dòng)[21]，或采用多渠道電極覆蓋整個(gè)樣品[3]，以此來(lái)確定漏孔的具體位置。該法的應(yīng)用有一定局限性。首先是對(duì)注射劑狀態(tài)和包裝有選擇性，注射劑必須是液體或半液體狀態(tài)且不易燃燒，包裝應(yīng)該是絕緣性能比較好的材料，如玻璃、彈性體和塑料等[22];其次是檢測(cè)結(jié)果受包裝表面的水分影響較大，包裝表面若存在水分，會(huì)降低包裝的電阻，導(dǎo)致通過(guò)包裝的電流值增大，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[5]。因此，采用該法檢測(cè)時(shí)要避免包裝表面出現(xiàn)水分，特別是放置溫度較低的穩(wěn)定性樣品，取出后要在室溫下進(jìn)行充分平衡，避免測(cè)試時(shí)包裝表面出現(xiàn)冷凝水，從而影響檢測(cè)結(jié)果[20]。2.5氣體示蹤法氣體示蹤法的檢測(cè)對(duì)象為通過(guò)包裝漏孔泄漏出的示蹤氣體，適用范圍較廣，可用于無(wú)孔的硬質(zhì)包裝[23－25]和柔性包裝[26－27]的檢測(cè)，包裝的容積覆蓋小包裝到幾升的大包裝。示蹤氣體有氦氣和氫氣。氦氣具有無(wú)毒、惰性、價(jià)格便宜、在大氣中含量較小、檢測(cè)時(shí)背景值較低等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際檢測(cè)中使用更多。氦氣示蹤法又稱(chēng)為氦質(zhì)譜法，有真空檢測(cè)和嗅探檢測(cè)2種模式。氦質(zhì)譜真空檢測(cè)模式是將充氦氣的測(cè)試包裝放入真空測(cè)試倉(cāng)內(nèi)，對(duì)測(cè)試倉(cāng)進(jìn)行抽真空，氦氣通過(guò)漏孔泄漏出包裝，被氦質(zhì)譜檢測(cè)器所檢測(cè)，最后以氦氣的泄漏率來(lái)判定包裝是否泄漏(參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)ASTMF2391)。氦質(zhì)譜檢測(cè)器的靈敏度高和大氣中氦氣背景含量值很低[9]，因此氦質(zhì)譜法真空檢測(cè)模式的靈敏度非常高，且是目前檢測(cè)靈敏度最高的方法。對(duì)于硬質(zhì)包裝，檢出限可以達(dá)到10－7～10－5

scc/s，相當(dāng)于玻璃微量滴管名義孔徑0.1～0.3μm[23，28]，柔性包裝袋中的檢出限可達(dá)到針孔型漏孔10μm[26]。氦質(zhì)譜真空檢測(cè)模式的靈敏度能夠滿(mǎn)足硬質(zhì)包裝最大允許泄漏限度值的要求，采用該法可以免除與微生物挑戰(zhàn)法或示蹤液體法的比較研究。鑒于真空模式的高靈敏度，該法常用于研究泄漏率或漏孔大小與微生物侵入概率的關(guān)系[28]，也用于研究泄漏率與漏孔尺寸的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)泄漏率與玻璃微量滴管和激光打孔的名義孔徑的平方均成正比[24，29]。真空檢測(cè)模式能夠檢測(cè)整個(gè)包裝，也能夠檢測(cè)包裝的某一部分，如包裝部分表面和封口處。氦質(zhì)譜嗅探檢測(cè)模式是采用與氦質(zhì)譜檢測(cè)器相連的嗅探探針掃描包裝表面，以捕捉和檢測(cè)泄漏的示蹤氦氣的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)包裝漏孔的位置。實(shí)際應(yīng)用中，需要確定漏孔具體位置時(shí)才選用該方法。從包裝內(nèi)泄漏出的示蹤氦氣在包裝表面的集聚是不可預(yù)測(cè)的，且嗅探掃描程序由于操作者的技能差異而對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，因此該方法是一種概率性檢測(cè)方法。氣體示蹤法也有一些缺陷。首先是檢測(cè)結(jié)果易受示蹤氣體的滲透影響。示蹤氣體可能會(huì)滲透通過(guò)包裝壁(特別是塑料和橡膠類(lèi)的包裝壁)，從而掩蓋泄漏的示蹤氣體，造成假陽(yáng)性結(jié)果。采用氦質(zhì)譜法真空檢測(cè)模式時(shí)，泄漏閾值應(yīng)該根據(jù)檢測(cè)的溫度來(lái)確定，因?yàn)楹庠诓煌瑴囟认聺B透性能不一樣，溫度越高，氦氣的滲透性能越強(qiáng)。如果以低溫時(shí)的泄漏閾值來(lái)判定較高溫度時(shí)的泄漏率，較高溫度下氦氣的滲透量有可能超過(guò)低溫時(shí)的泄漏閾值，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[3]。因此，要充分評(píng)估示蹤氣體滲透對(duì)泄漏檢測(cè)結(jié)果的影響。其次是不適宜檢測(cè)小包裝的大漏。灌注示蹤氣體和泄漏檢測(cè)有一定的時(shí)間間隔，在這段時(shí)間內(nèi)，對(duì)于一些具有大漏孔的小包裝，填充在包裝內(nèi)的示蹤氣體可能會(huì)通過(guò)大漏孔全部逃逸，在檢測(cè)時(shí)沒(méi)有示蹤氣體逸出包裝，出現(xiàn)假陰性結(jié)果[9]。另外，在檢測(cè)注射液包裝時(shí)，特別是在真空模式下，應(yīng)避免注射液或其揮發(fā)生成的水蒸氣進(jìn)入測(cè)試系統(tǒng)損壞檢測(cè)設(shè)備[5]。2.6微生物挑戰(zhàn)法微生物挑戰(zhàn)法檢測(cè)在高濃度微生物環(huán)境下是否有微生物侵入包裝，通過(guò)向空包裝中注入無(wú)菌培養(yǎng)基，密封，滅菌，培養(yǎng)，檢查包裝內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng)。若包裝內(nèi)無(wú)菌落生長(zhǎng)，將包裝放入具有高濃度微生物的介質(zhì)中，施加一定驅(qū)動(dòng)力并保持一定時(shí)間，促進(jìn)介質(zhì)中的微生物通過(guò)漏孔向包裝內(nèi)轉(zhuǎn)移;然后撤銷(xiāo)驅(qū)動(dòng)力，使樣品在大氣壓環(huán)境下平衡一定時(shí)間;再將樣品從介質(zhì)中取出并進(jìn)行微生物培養(yǎng)，采用視覺(jué)觀察法，檢查包裝內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng)。微生物挑戰(zhàn)法的檢出限一般為玻璃微量滴管名義孔徑5μm[5]。根據(jù)含有高濃度微生物的介質(zhì)不同，微生物挑戰(zhàn)法分為浸沒(méi)模式和氣溶膠模式。浸沒(méi)模式是以含有高濃度微生物的培養(yǎng)基為介質(zhì)。微生物挑戰(zhàn)法需選擇尺寸較小、運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)的微生物。浸沒(méi)模式常用的微生物有缺陷短波單胞菌Brevundimonasdiminuta、沙雷氏菌Serratiamarcescens[5，30]、大腸桿菌Escherichiacoli[31]，以及缺陷短波單胞菌和大腸桿菌的混合菌[28，32]。培養(yǎng)基介質(zhì)中微生物濃度一般不低于105

cfu/mL。常用的培養(yǎng)基有乳糖生理鹽水[28，31－32]和大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基[5]。乳糖生理鹽水為非蛋白培養(yǎng)基，不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞聚集，可避免漏孔堵塞[31]。浸沒(méi)模式主要用于硬質(zhì)包裝的檢測(cè)[28，31－32]。氣溶膠模式是以含有高濃度微生物的氣溶膠為介質(zhì)。氣溶膠中使用的微生物主要為金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和大腸桿菌Escherichiacoli。金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性菌，易獲取，菌落形態(tài)易鑒別，更重要的是在霧化過(guò)程中能完好地存活[33]。大腸桿菌為革蘭陰性菌，常用于生物氣溶膠樣品的測(cè)試[34－35]，因此也是氣溶膠檢測(cè)模式下較理想的菌種。采用特殊的噴霧器將菌液霧化形成的氣溶膠粒徑為1～5μm，有利于生成溶膠化的細(xì)菌[36]。氣溶膠中微生物的濃度一般不低于2.0×107

cfu/m3。氣溶膠模式對(duì)包裝施加的外力較小，主要適用于易產(chǎn)生形變的柔性包裝袋的檢測(cè)[6，36]。微生物挑戰(zhàn)法的檢測(cè)結(jié)果受眾多不確定因素影響。首先，微生物能否找到漏孔不可預(yù)測(cè)和控制;其次，即使微生物能找到漏孔，微生物能否順利通過(guò)漏孔進(jìn)入包裝也受諸多因素，如漏孔的幾何尺寸和形狀、包裝的材料和結(jié)構(gòu)、漏孔內(nèi)是否存在液體、菌液的表面強(qiáng)度、漏孔是否被堵塞等影響。微生物侵入的檢測(cè)結(jié)果是不可預(yù)測(cè)和不可控的，特別是漏孔較小時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的差異極大。故屬概率性檢測(cè)方法。另外，微生物挑戰(zhàn)法只適用于空包裝的檢測(cè)，不適用于含藥品包裝的檢測(cè)，檢測(cè)周期比較長(zhǎng)(每次需數(shù)周)。一般在沒(méi)有合適的方法，或其他檢測(cè)方法的結(jié)果需要微生物侵入的直接證據(jù)時(shí)才選用。2.7液體示蹤法液體示蹤法是檢測(cè)通過(guò)包裝漏孔的示蹤液體中示蹤劑的方法。通過(guò)將測(cè)試包裝置于裝有示蹤液體的容器中，把容器放入真空倉(cāng)中，對(duì)真空倉(cāng)進(jìn)行抽真空或加壓，并在相應(yīng)的真空度或壓力下保持一定的時(shí)間，釋放真空或壓力，在大氣壓條件下平衡一定時(shí)間，然后檢測(cè)包裝內(nèi)是否含有示蹤劑。示蹤液體主要有染料溶液、金屬離子溶液和放射性核素溶液。當(dāng)采用染料溶液作為示蹤液體時(shí)，又稱(chēng)為色水侵入法，常用的染料有亞甲基藍(lán)、赤蘚紅[31]和羅丹明B[3]等。試驗(yàn)前需將配制的染料溶液用0.2μm的膜過(guò)濾，以免染料溶液中的不溶性物質(zhì)造成漏孔堵塞[31]。金屬離子溶液常用的是含Mg2+溶液[32]。對(duì)于示蹤劑的檢測(cè)，主要有化學(xué)分析法和目測(cè)法?；瘜W(xué)分析法是采用化學(xué)分析手段對(duì)包裝內(nèi)示蹤劑的濃度進(jìn)行檢測(cè)，如采用紫外－可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)染料濃度，采用原子吸收光譜法分析Mg2+濃度[31－32]，但需對(duì)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。目測(cè)法主要用于色水侵入法，是對(duì)包裝內(nèi)是否有染料溶液侵入進(jìn)行視覺(jué)判斷，不但與檢測(cè)者的技能和經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，還受檢測(cè)環(huán)境如光照度、光源種類(lèi)、觀察背景等的影響。液體示蹤法是基于示蹤液體與漏孔的接觸、示蹤液體的侵入、示蹤劑的擴(kuò)散等多個(gè)環(huán)節(jié)的檢測(cè)方法，均具有不可預(yù)期性和不可控性，特別是在漏孔較小的情況下，即使漏孔孔徑相同，檢測(cè)結(jié)果的差異也較大[3]。因此，液體示蹤法也是典型的概率性檢測(cè)方法。液體示蹤法中使用得最多的是色水侵入法，色水侵入法的原理與微生物挑戰(zhàn)法相似，但