流式細(xì)胞儀應(yīng)用

TheApplicationsofFlowCytometry內(nèi)容流式細(xì)胞儀基本原理、應(yīng)用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量通過流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息

-相對細(xì)胞大小

-相對細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度

-染色過細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位

……流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖液流系統(tǒng)光路系統(tǒng)電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)光信號如何收集？光學(xué)收集器是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，可將產(chǎn)生的不同波長光信號引導(dǎo)至不同的電子探測器。直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low間接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high光學(xué)濾片分光器光電探測器信號名稱激發(fā)波長發(fā)射波長FCSSSCFL1FL2FL3FL4FITCPEPerPCAPC側(cè)向前向488488488488488633525575667660488488(FACSCalibur型

)光路系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光信號散射光信號熒光信號散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信號

細(xì)胞相對大小及其表面積。側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90

角的散射光信號

細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性。前向角散射光——FSCFALS

SensorLaser側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異

- 通常使用“散點(diǎn)圖”來看散射光信號

- 散點(diǎn)圖上的一個點(diǎn)就代表一個細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖——DotPlotReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?AB熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動能和熱能，釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強(qiáng) 流式圖片如何解讀？單參數(shù)直方圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖三維圖坐標(biāo)類型：線性放大坐標(biāo)，對數(shù)放大坐標(biāo)流式圖片如何解讀？單參數(shù)直方圖橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體雙參數(shù)二維點(diǎn)圖三維圖Pseudo3DPlot3DPlot流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？BDCalibur:cellquest軟件BDcantoII，Aria,LSR：DIVA軟件不同品牌，不同類型流式細(xì)胞儀使用的分析軟件不同。流式細(xì)胞儀同一數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)為FSC文件（國際流式協(xié)會制定）由斯坦福大學(xué)設(shè)計研發(fā)的一款非常強(qiáng)大的流式數(shù)據(jù)分析軟件---------FlowJo軟件陰性對照組和CD3FITC/CD19PE雙染樣本散點(diǎn)圖象限界定下圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽性細(xì)胞以及雙陽性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細(xì)胞（CD19PE），右下象限（LR）為X軸陽性細(xì)胞（CD3FITC），右上象限（UR）為雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來這些分析方法通常適用于計算離散細(xì)胞群的百分含量，對于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽性并不適用。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計細(xì)胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽性率越高流式幾個重要概念門：用于分析樣本內(nèi)的指定細(xì)胞同型對照

------除去熒光抗體的特異性決定位點(diǎn)，是真正意思上的陰性對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色

流式幾個重要概念例：一個雙色染色的實(shí)驗(yàn)抗體AFITC，抗體BPE

對應(yīng)的同型對照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要準(zhǔn)備的是陰性對照：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE單陽性對照：

FITC:細(xì)胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:細(xì)胞加上AbBPE,IgG1FITC流式幾個重要概念亦可在封閉是加入一抗來源的免疫球蛋白陰性對照cellonly流式幾個重要概念抗體染色一般方法外周血白細(xì)胞分析：100ul全血血小板分析：1-5ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量）紅細(xì)胞分析：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細(xì)胞數(shù)稀釋后使用）骨髓：20ul其他樣本，計數(shù)后決定使用體積目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測終濃度：1×106/ml孵育、溶血、固定抗體孵育：下避光20分鐘（某些情況下如：細(xì)胞內(nèi)因子檢測需冰育）固定：1%paraformaldehyde200ul重懸20min流式檢測對象要求？目標(biāo)物可以是細(xì)胞、細(xì)菌或各種微粒0.5um~50um范圍內(nèi)動物標(biāo)本來源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他。以及血清或各類體液樣本。Flowcytometryofapoptoticcelldeath凋亡細(xì)胞檢測方法一凋亡細(xì)胞檢測方法一凋亡細(xì)胞檢測方法二DNA鏈的斷裂細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200bp的DNA片段。斷裂的末端可以通過末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。Br-dUTP（三磷酸溴脫氧尿苷）鏈接DNA斷裂點(diǎn)檢測凋亡凋亡細(xì)胞檢測方法二凋亡細(xì)胞檢測方法三細(xì)胞DNA含量

在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。