肌動蛋白微絲在偽足形成中的作用

肌動蛋白微絲在偽足形成中的作用

偽腳是最原始的活動器官，包括maba細胞和其他親乳細胞。目前認為,偽足的形成是由于骨架再組裝驅(qū)動,特別是肌動蛋白微絲骨架的重組。偽足表現(xiàn)為一個突出的小泡,有時沿著下層基質(zhì)變得扁平(像扁平足),有時更圓或離開表面(像頭足)。熒光顯微鏡和電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn),這個區(qū)域總是包含有密集的纖維狀肌動蛋白(F-actin)微絲網(wǎng)絡(luò)和少量的微管。在活體細胞中,肌動蛋白(actin)的聚合主要發(fā)生在細胞延伸的邊緣,通過膜和微絲末端之間新增肌動蛋白單體的方式。用細胞骨架干擾劑限制actin的聚合,提供了直接的證據(jù)來說明actin微絲在移動中所起的作用。盡管actin微絲在偽足形成時所起的作用已被人們接受,但對于產(chǎn)生推力的機理仍有不同見解。涉及到推力的模型,從肌動蛋白聚合在膜上直接起作用到肌漿球蛋白的收縮或可利用的凝膠滲透壓驅(qū)使F-actin網(wǎng)絡(luò)的凝膠化等,均被提出說明偽足的擴展。肌動蛋白的形成微絲骨架(mirofilamentcytoskeleton)是細胞骨架的一種,微絲直徑僅5~8nm,呈圓筒狀,在細胞質(zhì)中成束狀平行排列或疏散成網(wǎng)狀。它主要是由肌動蛋白組裝的多聚體,和肌動蛋白結(jié)合蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-輔肌動蛋白等組成。前者又稱為肌動蛋白纖絲(actinfilaments),它具有高度的動態(tài)性,即未組裝的球狀肌動蛋白(G-actin)與F-actin在胞內(nèi)可以隨時組裝和解聚。有時可以是球狀蛋白組裝的單絲存在于細胞內(nèi),或幾個單絲組成的束,有時也可以看到更粗的集合體,稱為肌動蛋白索(actincables)。正常細胞中,G-actin與F-actin不斷轉(zhuǎn)換,達到平衡,并且只有聚合態(tài)的肌動蛋白才具有生物學(xué)作用。肌動蛋白是由兩個形似蠶豆瓣的區(qū)域構(gòu)成的球狀分子,中間由一個分子多肽鏈相連。存在一個中縫,中縫部分是肌動蛋白的必要因子ATP或ADP的金屬離子的結(jié)合部分。這些因子決定著它的穩(wěn)定狀態(tài)。在哺乳動物中至少發(fā)現(xiàn)了6種肌動蛋白肽,根據(jù)其電泳特點又將肌動蛋白分為α、β、γ3種。α-actin主要位于骨骼肌和心肌細胞,β-actin、γ-actin主要存在于非肌肉細胞中。肌動蛋白結(jié)合蛋白可以特異地與各種形式的肌動蛋白結(jié)合或分離,調(diào)節(jié)微絲的聚合、解離。細胞松弛素B則破壞微絲。微絲骨架大約有70多種肌動蛋白結(jié)合蛋白及輔助的解聚蛋白,在肌動蛋白的折疊、聚合、交聯(lián)、成晶現(xiàn)象及運動中起主要調(diào)節(jié)作用,包括跨連接蛋白(fimbrin、ABP-120、α-actinin等)、單體結(jié)合蛋白(cofilin、profilin、CAP)、膜錨蛋白(talin、comitin、ponticulin)、F-actin片斷和帽子蛋白(severin、DAip1),聚合啟動子(WASP,Scar)和馬達蛋白(myosin),這些蛋白常被Ca2+或磷酸肌醇等信號分子調(diào)節(jié)。如肌動蛋白的一個重要調(diào)節(jié)蛋白是profilin,它與自由單體肌動蛋白和F-actin的末端結(jié)合,阻止actin進一步聚合。profilin含有磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)結(jié)合位點,對PIP2具有高親合性,可抑制磷脂酶C(PLC)活性和PIP2水解。profilin結(jié)合PIP2后與微絲脫離,有利于肌動蛋白聚合,調(diào)節(jié)肌動蛋白單體濃度。另外它還可作為ADPactin和ATPactin的轉(zhuǎn)換因子。這些說明profilin在調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合過程中受到磷酸肌醇信號分子的作用。微絲骨架系統(tǒng)是一類復(fù)雜的蛋白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)與細胞的病理過程,如細胞的趨化、粘附、粘彈等過程密切相關(guān)。與此同時,細胞形態(tài)的維持、細胞分裂、胞內(nèi)物資的運輸和細胞分化等活動都與細胞骨架相關(guān)。所以,胞質(zhì)骨架的改變必然影響細胞功能。細胞移動的影響趨化原是單細胞生物最基本、最原始的運動形式,如變形蟲、溶組織阿米巴等靠體表任何部位形成臨時性的細胞質(zhì)突起(偽足)作為運動器而運動。所謂的趨化性,即是細胞朝向可溶性化學(xué)刺激方向遷移。某些真核細胞,如白細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、骨髓細胞、肝癌細胞、平滑肌細胞等體內(nèi)也具有明顯的趨化運動,且有些細胞自身可以分泌趨化因子。這些趨化因子在生理和非生理狀況下起重要作用,如可以促進細胞遷移,刺激血管的生成,參與腫瘤細胞的移動、侵襲和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)細胞因子的轉(zhuǎn)錄,促使多種淋巴因子的釋放等。細胞偽足形成及趨化運動是由趨化劑與細胞膜趨化受體結(jié)合后介導(dǎo)的主動耗能過程。它不同于細胞與外力作用下的被動變形。細胞的各種運動,如變形蟲運動(或阿米巴運動)、變皺膜運動,以及細胞的吞噬活動等,都與肌動蛋白的溶膠、凝膠狀態(tài)及其相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),偽足形成過程中微絲(肌動蛋白)組裝在細胞移動中起著重要作用。除了肌動蛋白的聚合,還有另外的幾種可能的機理,如凝膠滲透壓力,在細胞移動中也起一定的作用;如嗜中性粒細胞的趨化性偽足形成的受體作用機制,以及一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,如胞內(nèi)鈣離子的釋放、G蛋白偶聯(lián)的肌動蛋白的解聚,以及信號分子、細胞骨架不對稱和有持續(xù)的分配引起的細胞的極性等,倍受研究者關(guān)注。原生動物變形蟲在固體表面移動時,向前伸出一個或多個偽足,將體內(nèi)部分原生質(zhì)移入偽足內(nèi),后面的原生質(zhì)也隨著收縮前進,不斷地補充向前流動的原生質(zhì),整個細胞逐漸移向前方。變形蟲就是這樣依靠細胞內(nèi)原生質(zhì)流動才向前運動和捕捉食物的。這種原生質(zhì)流動,實質(zhì)上是依靠微絲的肌動蛋白和肌球蛋白聚合體之間的滑動來實現(xiàn)的。如果變形蟲經(jīng)細胞松弛素B處理,即可中止原生質(zhì)流動和偽足的擴散。表明微絲參與了非肌肉細胞的變形運動。高等動物中白細胞和巨噬細胞運動也與上述變形蟲運動相似。在哺乳類成纖維細胞體外培養(yǎng)過程中,可觀察到細胞膜表面皺縮,形成若干波動式的褶皺和較長的突起。細胞移動就是依靠這些褶皺和突起,不斷交替與表面相接觸來實現(xiàn)的。在移動時,原生質(zhì)也跟著流動,但僅出現(xiàn)于細胞邊緣區(qū)。如果用細胞松弛素B處理,即觀察到皺縮運動受到抑制;當除去細胞松弛素B(1~2h),這種運動可逐漸恢復(fù)。由此可見,細胞產(chǎn)生皺膜的運動也與細胞骨架微絲有關(guān)。Francis等通過電鏡,觀察了鼠Sca-1+/Lin-細胞和人類KG1a細胞在細胞移動中的多樣性形態(tài)。像典型的手鏡形偽足、寬廣的扁平足、尾足、動態(tài)的絲狀偽足、伸縮纖維等。Dictyostelium細胞在其生長環(huán)境中也顯示了趨化性現(xiàn)象,如在生長環(huán)階段攝取細菌,及性循環(huán)階段形成巨囊等。細胞的極性在某種形式上也是趨化的過程,如單細胞核和多細胞核的dictyostelium產(chǎn)生分級階段,早期趨化時需要單個細胞迅速重組裝其細胞骨架來產(chǎn)生cAMP,這就涉及到F-actin聚合并在相反的方向上抑制偽足。大量的研究主要在集合體階段,細胞朝向脈動的cAMP信號方向移動,發(fā)展中的dictyostelium細胞在cAMP資源豐富區(qū)延伸偽足,改變其極性。胞膜自身力學(xué)特性的改變應(yīng)用細胞及分子生物學(xué)方法,人們對阿米巴原蟲、中性白細胞以及部分癌細胞,如惡性黑色素瘤細胞的趨化行為已有相當?shù)难芯?但對于趨化運動的機理、偽足形成的機制還遠未達到詳細的了解,如趨化相關(guān)受體機制、偽足形成的胞內(nèi)信號機制、偽足形成的亞細胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(如細胞骨架等)等機制。對上述問題的研究將極大提高對偽足形成過程及相關(guān)趨化機理的認識,并促進癌轉(zhuǎn)移、免疫炎癥等醫(yī)學(xué)問題的研究。癌細胞偽足形成及趨化運動是癌細胞侵襲過程中的重要生物學(xué)行為。偽足形成涉及一系列的復(fù)雜的相互作用,如趨化劑和趨化受體的結(jié)合及有關(guān)信號機制、細胞膜局部力學(xué)特性的改變、肌動蛋白解聚及滲透壓的作用、肌動蛋白聚合以及鈣離子的作用。這些研究對于在細胞生物學(xué)水平認識偽足形成極性或細胞趨化運動方向性的相關(guān)機理具有重要的理論和應(yīng)用意義。為解釋促使偽足形成的趨動力,形成了很多研究模型,它們主要建立在肌動蛋白生物化學(xué)和某些細胞在趨化液刺激下其內(nèi)部細胞骨架改變的基礎(chǔ)上。以此兩種材料研究居多:多形核白細胞(PMN)和Dictyostelium。并根據(jù)其細胞的變形提出了兩種很有影響力的模型,分別是PMN模型和皮層擴展模型。皮層擴展模型認為,經(jīng)過趨化受體刺激后,局部肌動蛋白的聚合和跨連接是使細胞偽足形成的瞬間原動力。而后跟隨的肌動蛋白凝膠的滲透膨脹引起微絲的解聚,促進偽足的進一步擴展。而PMN模型則認為,起初偽足延伸的作用力是局部的Ca2+激活的肌動蛋白凝膠的解聚,由此產(chǎn)生的滲透力膨脹使得細胞膜向外突出,于是形成了偽足。而PMN模型對偽足形成階段肌動蛋白解聚和聚合方面作了明確的區(qū)分。它認為,受體產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及通過Ca2+激活的凝膠蛋白的調(diào)節(jié)是引起局部肌動蛋白解聚的原因。接著肌動蛋白凝膠在細胞邊緣的瞬間分裂和膨脹,導(dǎo)致了膜的突出。由此看出,滲透壓是驅(qū)動偽足形成的原動力。后來的肌動蛋白的重聚和跨連接加速和穩(wěn)定了新的偽足的形成。肌動蛋白的重聚開始于PI代謝循環(huán)。有學(xué)者應(yīng)用微管吸吮技術(shù)揭示在瘤細胞中的偽足形成有兩個時相:膜泡階段和規(guī)則延伸。此過程通過分開的胞內(nèi)信號的調(diào)節(jié)而完成。IV型膠原激活了G-蛋白偶聯(lián)的受體,刺激趨化,引起了短暫的胞內(nèi)鈣離子的釋放。運用pertussistoxin(PT)限制細胞內(nèi)微絲骨架的組裝,即阻斷了G-蛋白偶聯(lián)的actin的聚合,則細胞仍有小泡向外延伸,說明滲透壓在起作用。然而,也有人研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子的增加對于肌動蛋白聚合并不是必須的。偽足的形成機理細胞骨架在細胞的粘附、偽足形成等特性和過程中,起著非常重要的作用?，F(xiàn)代研究越來越表明,粘附分子-受體-細胞骨架之間的相互作用,在胞內(nèi)外的信號傳遞過程中,起著越來越重要的作用。因此,對于特定細胞、特定胞外信號,肌動蛋白聚合和肌動蛋白微絲的動態(tài)分布在局部細胞移動中所起的作用更不容忽視。許多細胞的移動與肌動蛋白和肌漿球蛋白I、II有關(guān)。除肌動蛋白聚合之外,細胞的移動還有其他幾種可能機理,如靜電壓力、膠體滲透壓、局部的跨膜滲透壓、界面張力或界面壓力等。實驗表明,膠體和跨膜滲透壓最可能支配細胞的動態(tài)移動。為了分析肌動蛋白聚合和肌動蛋白凝膠的支配偽足形成的相關(guān)規(guī)律,人們在研究Acrasisrosea和Protostelium噬真菌體等阿米巴的肌漿球蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)和功能時也發(fā)現(xiàn),它們的F-actin束從內(nèi)生的質(zhì)膜與外部的質(zhì)膜間形成偽足,而那里也定位著G-actin。于是得出結(jié)論,這些肌動蛋白束形成了一個網(wǎng)絡(luò)支架驅(qū)動著偽足的形成,因此得以繼續(xù)組裝更多松散的F-actin網(wǎng)絡(luò)。一些兩極伸長的Acrasisrosea阿米巴也含有長束的F-actin,橫越整個細胞并且遙控著散在細胞中的應(yīng)力纖維棒,或形成星狀或多邊形混合物圍繞在收縮性的液泡周圍。它們也許在收縮性上起著重要作用。結(jié)合從前發(fā)現(xiàn),偽足能夠通過actin和肌漿球蛋白的相互作用或者只是通過actin的聚合而形成,由此得出結(jié)論,actin微絲束趨動著細胞偽足的延伸。在偽足形成時,單個的actin微絲并不能充分剛性地推動細胞膜外突,盡管它有巨大的力量。也有人提出偽足形成的兩個次序性事件是,首先F-actin束的形成和它們的延伸超過了細胞總體的邊緣,明顯的表現(xiàn)是偽足形成時細胞膜的突出。其次,具有凝膠性質(zhì)的F-actin網(wǎng)絡(luò)骨架的形成擴充了偽足或者填充了它們的空間,而這正如皮層擴展模型中所預(yù)料到的一樣。當阿米巴突然改變了移動的路徑,如偽足被收回,收回的纖維在偽足剛剛出現(xiàn)的區(qū)域形成。這表明,相對穩(wěn)定且動態(tài)的F-actin束是偽足首要的支撐元素,首先出現(xiàn)在偽足的延伸和擴展中,并在其收回時被破壞。Hodgson等曾以黑色素瘤細胞作為材料,研究其偽足形成機理,瘤細胞展示了同多形核白細胞和低等的真核細胞Dictyostelium一樣的阿米巴運動,它們的移動特征是偽足伸出到細胞的外圍。當前絕大部分的阿米巴趨化機理來自于研究PMN白細胞和Dictyostelium阿米巴,而此兩種機理在某些方面也有相似性。偽足形成在趨化刺激作用下是最早的形態(tài)反應(yīng),而偽足是細胞皮層的特化區(qū),它主要包含有肌動蛋白微絲的跨連接網(wǎng)絡(luò)。局部的趨化刺激引起了細胞外圍的肌動蛋白微絲的重建,而導(dǎo)致了細胞偽足的延伸和細胞的移動。然而偽足延伸中的胞外信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚未闡明。為了研究活體細胞中actin細胞骨架的動態(tài)分布,Cheng等通過在真核細胞中表達β-actin-GFP,轉(zhuǎn)染入NIH3T3纖維原細胞、293T人類胚胎腎癌細胞中,通過免疫熒光染色決定其內(nèi)生的actin的位置。而在趨化劑作用下可以在線觀察β-actin-GFP組裝過程。當趨化作用下偽足伸出時,β-actin-GFP的數(shù)量在整個臨近細胞表面的皮層區(qū)開始增加,隨著延伸的進展,熒光在這些細胞中變得更易于區(qū)分,并在大約1h內(nèi)監(jiān)測到β-actin組裝的改變和相對高濃度的綠色熒光在細胞的外圍擴展。Lee等又發(fā)現(xiàn),Dictyostelium阿米巴偽足形成時,actin微絲組裝發(fā)生了改變。熒光鬼筆環(huán)肽用于研究Dictyostelium阿米巴運動,目的是為了觀察偽足延伸時局部的F-actin微絲的改變。鬼筆環(huán)肽(profilin)起初定位在細胞的外圍,而新偽足的形成并未有熒光產(chǎn)生,表明鬼筆環(huán)肽是緊密結(jié)合在存在的F-actin微絲上,并未迅速重新定位到新形成的微絲上。隨著偽足的延伸,熒光信號從潛在的擴展區(qū)消失,留下了一個actin皮層縫隙。在野生型細胞和肌漿球蛋白II重鏈缺失的細胞中得到了相似的結(jié)果。熒光信號從新的偽足形成區(qū)的消失,表明新的偽足形成并非建立在已存在的微絲皮層上,而是建立在局部被溶膠化作為新的actin網(wǎng)絡(luò)皮層上。在新偽足的延伸區(qū),熒光的缺失并不意味著這些結(jié)構(gòu)缺乏肌動蛋白微絲。既然profilin非常緊密地結(jié)合到F-actin微絲上,因此交換不能迅速發(fā)生在新的偽足形成區(qū)。所以,在偽足延伸時電穿孔profilin只是出現(xiàn)在已存在的皮層actin網(wǎng)架結(jié)構(gòu)中,并沒有分布在新形成的actin微絲中。膜伸展以后則觀察到profilin區(qū)表面的解聚表現(xiàn)明顯。隨著延伸的加速,在皮層區(qū)熒光變得模糊并散開,特別在偽足形成的中心區(qū)。有時在皮層區(qū)出現(xiàn)明顯的熒光間隙。在缺乏myosinII的野生性細胞也有此結(jié)果,表明myosinII并不通過此機理來產(chǎn)生皮層間隙。細胞的極性是所有細胞的基本特征,它包含有很多細胞生物學(xué)過程,如細胞的趨化過程。如果沒有極化細胞骨架,細胞不能夠移動。已發(fā)現(xiàn)作用于細胞極性的幾種蛋白成分和信號途徑。生長的細胞通過伸長偽足迅速改變其極性。由于胞外的cAMP成分使細胞變得無極性,并停止運動,此時被稱作萎縮反應(yīng)。通過F-actin聚合