多菌株混合微生態(tài)制劑的研制

多菌株混合微生態(tài)制劑的研制

通過有效的干燥工藝和空腔制備的多株一方面性疾病可以促進山羊和小麥的生長，抑制山羊和細菌的生長，治療山羊和腸道疾病，凈化養(yǎng)殖環(huán)境，減少獸醫(yī)對環(huán)境的污染，解決抗生素和其他化學品的抗性和藥物殘留問題。本制劑系由醫(yī)用單菌種微生態(tài)制劑衍生而來,加之使用對象間在生理特性存在差異,其檢驗規(guī)程和質量標準應該對制劑中多菌種進行嚴格的分株定量檢測、分類鑒定和安全檢驗,以避免負面效應。本研究旨在探討多菌株混合微生態(tài)制劑產(chǎn)品質量標準,為國內微生態(tài)制劑產(chǎn)品質量控制的進一步規(guī)范化提供參考。1naoh溶液(1)試劑：多菌株混合微生態(tài)制劑產(chǎn)品、菌株選擇性培養(yǎng)基、9ml無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、結晶紫、pH值試紙、pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液、0.1mol/l的NaOH溶液。95%酒精、稀硫酸(1:10)、1%中性紅溶液、6.5%NaCl溶液、2%NaCl溶液、1%NaCl溶液、0.9%NaCl溶液。(2)儀器用具：超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、油鏡顯微鏡、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、堿式滴定儀、無菌培養(yǎng)皿、瓷盤、1ml無菌吸管、滅菌移液管、試管、50ml具塞刻度試管、三角瓶、燒杯、量筒、溫度計、酒精燈、接種環(huán)、接種針、鑷子、載玻片、蓋玻片、血球計數(shù)板、記號筆、酒精棉球。2多株生殖器主要用于制備制劑中各益生菌的主要生物學性狀見表1。3選擇性培養(yǎng)和長壽繁殖3.1稀釋液的稀釋、發(fā)酵、菌種的篩選3.1.1本研究優(yōu)選的酵母菌選擇性培養(yǎng)基：通過YPD瓊脂培養(yǎng)基(見表2)接種的酵母菌由1.05×107cfu/ml提高到2.21×107cfu/ml,方差分析表明,采用YPD瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的酵母菌數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的酵母菌數(shù)量有顯著差異。調節(jié)pH值為6.8±0.2,加熱溶解,分裝后于121℃下高壓滅菌15～20min備用。3.1.3稀釋液制備：準確稱取8.5g氯化鈉溶解于1000ml蒸餾水中，分別以225ml分裝于內含有數(shù)十粒玻璃珠的三角瓶中，以9ml分裝于18mm×180mm的試管中（試管編號為2～5號），置于滅菌鍋內，121℃滅菌30min，備用。3.1.4稱取樣品25g，放入含有225ml生理鹽水的滅菌三角瓶中，經(jīng)充分振蕩20～30min，制成101～100倍的稀釋液。3.1.5用移液器吸取101～100倍稀釋液1ml于內含有9ml生理鹽水的2號試管中，混合均勻，制成10-2倍稀釋液，依次制成10-2～10-5倍不同梯度的稀釋液。3.1.6每個樣品選2個稀釋度，酵母菌選10-4、10-5稀釋度，乳酸桿菌選10-2、10-3稀釋度。吸取1ml菌懸液于相應編號的無菌平皿內，每個稀釋度做2個平皿，再倒入已冷至45℃的各自培養(yǎng)基15～20ml，邊倒邊搖，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻。3.1.7待培養(yǎng)基凝固后,將培養(yǎng)皿倒轉過來,酵母菌置于(27±1)℃的生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)(48±3)h;乳酸桿菌置于(27±1)℃生化的培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)(72±3)h。3.1.9結果計算計數(shù)后，先分別計算相應的菌數(shù)比例，如挑選的5個菌落中有4個符合上述要求，則其菌數(shù)比例4/5，再計算平均值。每克樣品活菌數(shù)=同一稀釋度各重復平皿的菌落平均數(shù)×菌數(shù)比例×稀釋倍數(shù)×53.2雙歧桿菌的培養(yǎng)3.2.1本研究優(yōu)選的枯草芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基:通過優(yōu)選的PCA培養(yǎng)基接種的枯草芽孢桿菌由8.32×108cfu/ml提高到3.10×109cfu/ml,方差分析表明,采用PCA培養(yǎng)基(見表4)培養(yǎng)出的枯草芽孢桿菌的數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的枯草芽孢桿菌的數(shù)量有十分顯著的差異。3.2.2本研究優(yōu)選的雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基：通過優(yōu)選改良BBL瓊脂培養(yǎng)基接種的雙歧桿菌由1.98×108cfu/ml提高到3.24×108cfu/ml，方差分析表明，采用改良BBL瓊脂培養(yǎng)基（見表5）培養(yǎng)出的雙歧桿菌的數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的雙歧桿菌的數(shù)量有顯著差異。雙歧桿菌在改良BBL培養(yǎng)基上生長良好，乳酸桿菌在改良BBL培養(yǎng)基上不生長。3.2.3調節(jié)培養(yǎng)液pH值7.0±0.2，分裝到試管中，在121℃高壓滅菌15min后待冷至55～60℃時倒入平板，右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕拔出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置在桌面上待凝，培養(yǎng)基凝固后將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。3.2.4稀釋液制備:將經(jīng)過充分混勻的試樣25g,在80℃下滅菌10min,放入含有495ml無菌水帶玻璃珠的滅菌三角瓶內,靜置20min后置于旋轉式搖床上,以200r/min的轉速搖5min,即成1%的稀釋液。3.2.6用200μl移液器分別吸取稀釋度為1:1×106、1:1×107、1:1×108的稀釋液100μl，加至平皿內的無菌培養(yǎng)基表面，用無菌涂布器將菌懸液均勻地涂布于培養(yǎng)基表面。每一稀釋度重復3次，同時加無菌水的空白對照，37℃培養(yǎng)20～40h，每個稀釋度取5～10個菌落的菌體，涂片染色，鏡檢，計數(shù)菌落。3.2.7按最大稀釋度確定菌落總數(shù)以平板上出現(xiàn)30～300cfu菌落的稀釋度為計數(shù)標準。當只有一個稀釋度，其平均菌落數(shù)在30～300cfu，則以該平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)；若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30～300cfu，應按兩面三刀者菌落總數(shù)之比值來確定；若其比值小于等于2應計數(shù)兩者的平均數(shù)，若大于是則計數(shù)其中稀釋度較小的菌落總數(shù)；若三個稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300cfu，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；若三個稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30cfu，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；若三個稀釋度的平均菌落數(shù)確均不在30～300cfu，則以最近300或30cfu的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。3.2.8菌落計數(shù)c每克樣品的活菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復的平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)式中：N———樣品中菌落數(shù)；ΣC———平板菌落數(shù)之和；n1———第一適宜稀釋度（1:100）平板上的菌落數(shù);n2———第二適宜稀釋度（1:1000）平板上的菌落數(shù)；d———第一稀釋度。3.3培養(yǎng)條件：pse平板3.3.1本研究優(yōu)選的腸球菌選擇性培養(yǎng)基通過PSE瓊脂培養(yǎng)基（見表6）接種的腸球菌由0.81×109cfu/ml提高到2.92×109cfu/ml，方差分析表明，采用PSE瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的腸球菌數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的腸球菌數(shù)量有顯著差異。3.3.2將融化的PSE瓊脂培養(yǎng)于45～50℃保溫，保溫時間不要超過4h，傾注于平板。3.3.3取25g樣品，放入225ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，制成1:10樣品稀釋液。取1ml適當稀釋的樣液加入90mm×15mm的培養(yǎng)皿內，傾入12～15ml已融化約45℃的PSE瓊脂培養(yǎng)基，輕輕轉動培養(yǎng)皿，使樣液與培養(yǎng)基充分混合，讓細菌均勻分散在培養(yǎng)基內。從樣品稀釋液制備至傾注平板時間不要超過20min。待平板凝固后倒置平皿進行培養(yǎng)，PSE平板置（36±1）℃培養(yǎng)（24±2)h。3.3.4菌落計數(shù)：糞鏈球菌群細菌在PSE瓊脂平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。使用有適當光源的低倍大視野雙目解剖鏡或效能相當?shù)钠渌鈱W儀器，對有30～300個菌落的平板進行菌落計數(shù)。按糞鏈菌群數(shù)/g(ml）報告結果。3.4用血球計數(shù)板測定了美國曲霉菌的數(shù)量將孢子懸浮液放在血球計數(shù)板與蓋片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)，根據(jù)在顯微鏡下觀察到的孢子數(shù)目來計算單位體積的孢子總數(shù)。3.4.1種曲子的稀釋精確稱取樣品1g(稱準至0.002g)，倒人盛有玻璃珠的250ml三角瓶內，加入95%酒精5ml、無菌水20ml、稀硫酸(1:10)10ml，在旋渦均勻器上充分振蕩，使種曲孢子分散，然后用3層紗布過濾，用無菌水反復沖洗，使濾渣不含孢子，最后稀釋至500ml。3.4.2稀釋液的u3000加入取潔凈干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，用無菌滴管取孢子稀釋液1小滴，滴于蓋玻片的邊緣處(不宜過多)，讓滴液自行滲入計數(shù)室中，不可有氣泡產(chǎn)生。3.4.3中央一個中格的數(shù)目使用16×25規(guī)格的計數(shù)板時，只計板上4個角上的4個中格(即100個小格)，如果使用25×16規(guī)格的計數(shù)板，除計4個角上的4個中格外，還需要計中央一個中格的數(shù)目(即80個小格)。每個樣品重復觀察計數(shù)不少于2次，然后取其平均值。3.4.4pbp小格內培養(yǎng)液數(shù)16×25規(guī)格的計數(shù)板：孢子數(shù)（個/g）=(n/100)×400×10000×（V/m）式中：n———100小格內孢子總數(shù)（個）；V———孢子稀釋液體（ml）;m———樣品質量（g）。25×16規(guī)格的計數(shù)板：孢子數(shù)（個/g）=(n/80)×400×10000×（V/m）式中：n———80小格內孢子總數(shù)（個）；V———孢子稀釋液體（ml）;m———樣品質量（g）。4鹽和氯化鈉的制備本研究優(yōu)選的雜菌選擇性培養(yǎng)基為麥康凱瓊脂（見表7）。用麥康凱瓊脂為腸道致病菌和非發(fā)酵細菌的選擇性培養(yǎng)基，其中的膽鹽可抑制革蘭陽性細菌生長，而對傷寒等沙門菌有促進生長的作用。制法如下：(1)將蛋白胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400ml蒸餾水中，校正pH值7.2，加入600ml瓊脂，加熱溶解，分裝于三角瓶內，在121℃下高壓滅菌15min備用。(2)臨用時加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至50～55℃時，加入結晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。結晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。按總量3%～5%抽樣，最低不少于5件，稱取供試品1g，加到9ml滅菌0.9%氯化鈉溶液或其它適宜稀釋液中,混勻，按10-1、10-2、10-3…10-10稀釋度稀釋，取適宜稀釋度供試液0.1ml加到已備好的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，一式3份，倒置，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每天觀察結果，記錄平皿上生長的菌落數(shù)。5家兔的體外藥動學用10億個菌液皮下注射小白鼠3～5只，觀察7～14d，并用家兔5只，各灌胃口服50億個菌，觀察5～7d。如引起發(fā)病或出現(xiàn)中毒癥狀，即確定為致病菌，凡染有致病菌的產(chǎn)品一律廢棄。6灌胃自治指標取2g制品加入8ml生理鹽水中，混合均勻，用5只體重18～22g小鼠，每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5ml，每天1次，連續(xù)3d。自第1日灌胃起，連續(xù)觀察7d，小鼠應健康存活、體重增加，判為合格。如不符合規(guī)定，可用10只小鼠復試1次，判定標準同前。安全試驗不合格產(chǎn)品不能出廠。7樣量及樣量每批產(chǎn)品的取樣數(shù)量不得少于5件，每件采樣量為一般為25g。通過以上試驗，結合規(guī)?；a(chǎn)時的工藝條件，本獸用多菌株混合微生態(tài)制劑的質量標準暫定如表8所述。8活菌生存時間活菌一般怕光、怕熱，有的怕凍、怕潮濕；溫度越高，濕度越大，活菌生存時間越短。經(jīng)倉儲試驗，產(chǎn)品在2～8℃下冷貯，保質期可達12個月。也可在37℃以下室溫貯存，但10℃以上時溫度倉儲，隨著室溫每升高10℃，保質期縮短2～3個月。9腸道致病性菌株的篩選9.1本研究基于優(yōu)選選擇性培養(yǎng)基，實現(xiàn)制劑中各菌株的分株培養(yǎng)，方法可靠；用血球計數(shù)板法進行菌落計數(shù)，方法簡便、快捷，可作為同類微生態(tài)制劑產(chǎn)品質量控制、安全評價的參考。9.2本研究所制訂的“獸用多菌株混合微生態(tài)制劑暫行質量標準”在雜菌病原性鑒定、安全試驗方法等方面有待進一步改進。應進一步從亞細胞和分子水平上研究微生態(tài)制劑的檢測技術，避免因菌株變異使制劑可能對動物產(chǎn)生的潛在危害。9.3益生活菌對酸、堿、熱較為敏感，本研究涉及的微生態(tài)制劑系畜禽口服劑，拌入飼料中，經(jīng)口服后其中的益生活菌必須經(jīng)過高酸的胃和高堿、高酶的腸道，消化道對益生菌有直接的破壞，益生菌在腸道內其活性和數(shù)量難免發(fā)生改變，因此，動物進食微生態(tài)制劑產(chǎn)品后，益生菌的有效活性問題有待進一步研究。9.4本研究所采用的麥康凱瓊脂選擇性培養(yǎng)基可對腸道致病菌和非發(fā)酵細菌進行選擇性培養(yǎng)，但有少數(shù)革蘭氏陰性菌不生長，對致病雜菌計數(shù)存在一定的影響。3.1.2本研究優(yōu)選的乳桿菌選擇性培養(yǎng)基:通過改良MC瓊脂培養(yǎng)基(見表3)接種的乳桿菌由2.11×108cfu/ml提高到4.32×108cfu/ml,方差分析表明,采用改良MC瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的乳桿菌的數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的乳桿菌數(shù)量有顯著差異。按照以上配方稱取試劑置于1000ml蒸餾水中,加熱溶解,調節(jié)pH值為6.0±0.2,加入中性紅液,分裝于三角瓶中,121℃高壓滅菌15～20min,備用。3.1.8培養(yǎng)結束后,選擇同一個稀釋度各個重復間的菌落數(shù)相差不太懸殊,且菌落數(shù)量在30～300cfu的培養(yǎng)皿進行分別計數(shù)。在YPD平板和改良MC平板上,各隨機挑選5個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。平板上菌落如呈革蘭氏陽性,鏡下細胞大且為圓形、卵圓形的為酵母菌;菌落如呈革蘭氏陽性,