雙熒光素酶報(bào)告基因分析promega

本文格式為Word版，下載可任意編輯——雙熒光素酶報(bào)告基因分析promega雙熒光素酶報(bào)告基因分析

1.介紹

熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控常被用來(lái)研究培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性。熒光素酶是理想的報(bào)告基因，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性熒光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的熒光素酶。

Dual-Luciferase?雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中含有在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的兩種熒光素酶。尋常，報(bào)告基因試驗(yàn)中往往會(huì)受到各種試驗(yàn)條件的影響，共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照〞報(bào)告基因會(huì)作為內(nèi)對(duì)照，為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線。試驗(yàn)報(bào)告基因經(jīng)過(guò)內(nèi)參照的處理可以減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率對(duì)試驗(yàn)的影響，因此雙報(bào)告系統(tǒng)減少了外部干擾，使得試驗(yàn)數(shù)據(jù)更可信。試驗(yàn)中報(bào)告基因和對(duì)照基因的酶沒(méi)有種源同源性，螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，反應(yīng)中沒(méi)有任何的交織干擾。

螢火蟲(chóng)熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物分別與檢測(cè)試劑反應(yīng)可以使靈敏度最大化。由于超強(qiáng)的光信號(hào)和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于制藥和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)適配于各種培養(yǎng)哺乳細(xì)胞的培養(yǎng)基，如1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等。這些試劑與被動(dòng)裂解液所附帶的試劑盒，可以從Promega試劑盒中分開(kāi)，單獨(dú)使用。

具有超高靈敏度和超寬線性范圍的Veritas?微孔板發(fā)光檢測(cè)儀特別適合DLR報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，Veritas?軟件中預(yù)裝了DLR的檢測(cè)程序使得安裝更為便利，內(nèi)置自動(dòng)加樣器使得應(yīng)用更為簡(jiǎn)單。

Veritas?微孔板發(fā)光檢測(cè)儀使用熒光素酶檢測(cè)試

劑II(LARII)最低可以檢測(cè)到1X10-19mol熒光素酶分子，使用Stop&Glo?試劑可以檢測(cè)到1X10-18mol海腎熒光素酶分子，檢測(cè)線性范圍分別為8和6個(gè)數(shù)量級(jí)。所有的檢測(cè)均采用純化的重組螢火蟲(chóng)熒光素酶(E1701)和純化的重組海腎熒光素酶。

圖1－3使用Promega公司Dual-Luciferase?雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，螢火蟲(chóng)熒光素酶(1x10-19到1x10-11mol)和海腎熒光素酶(1x10-14mol)在Modulus?儀上測(cè)量結(jié)果。

2.所需器材

?Veritas?微孔板發(fā)光檢測(cè)儀

（http://./equip/GloMax/Veritas.asp）(P/N9100-002)

?96孔白板(E&KScientificEK-25075)?Dual-LuciferaseReporter?熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(E1980)

?P200移液器和槍頭3.試驗(yàn)方案3.1試劑制備

熒光素酶檢測(cè)緩沖液II和熒光素酶檢測(cè)底物：使用所提供產(chǎn)品，－20℃儲(chǔ)存，可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，熒光素酶檢測(cè)底物可以4℃保存1個(gè)月。將熒光素酶檢測(cè)緩沖液II參與熒光素酶檢測(cè)底物中，配制DLR工作液，顛倒混合，直終究物完全溶解。配好試劑最好當(dāng)天使用，也可以將配好試劑分裝，-20°C儲(chǔ)存1月，-70℃儲(chǔ)存1年。Stop&Glo?底物和Stop&Glo?底物緩沖液：使用所提供產(chǎn)品，－20℃儲(chǔ)存。

Stop&Glo?底物溶解緩沖液：使用所提供產(chǎn)品，低于25℃儲(chǔ)存。在玻璃管或者硅化聚丙烯酸樹(shù)脂管中將

50×Stop&Glo?底物稀釋成1×Stop&Glo?工作液。顛倒混合，工作液最好當(dāng)天使用，也可以將工作液分裝，-20°C儲(chǔ)存2周。

被動(dòng)裂解緩沖液：用去離子水將5x被動(dòng)裂解緩沖液稀釋成1x的，低于25°C保存。

注：由于熒光素酶活性受溫度影響，在定量發(fā)光檢測(cè)過(guò)程中Dual-Luciferase?熒光素酶緩沖液II和Stop&Glo?緩沖液應(yīng)始終保持室溫?；旌显噭﹥龃婧笤俅问褂茫瑸榇_保試劑性能，應(yīng)在低于25℃條件下溶解。溶解后充分混勻，最簡(jiǎn)單的方法是室溫水浴溶解。3.2儀器安裝

3.2.1雙擊Veritas圖標(biāo)運(yùn)行軟件；

3.2.2從\對(duì)話框中點(diǎn)擊\PromegaProtocol\；

3.2.3瀏覽\文件夾，選擇適合的檢測(cè)程序，例如DLR檢測(cè)中使用的是單注射器那就選擇\injection.\；

3.2