坐骨神經(jīng)切斷術(shù)大鼠骨組織結(jié)構(gòu)改變的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

坐骨神經(jīng)切斷術(shù)大鼠骨組織結(jié)構(gòu)改變的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

廢除骨松解是一種機(jī)械應(yīng)力減少導(dǎo)致局部或整體骨失去和骨重減輕的局部或整體骨松解。2011年6—10月本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠廢用性骨質(zhì)疏松模型,在造模后不同時(shí)間段對其血、尿生化水平變化,骨組織形態(tài)學(xué)檢測方面進(jìn)行評價(jià),為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1模型的制作與分組1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡SD大鼠78只,體重(283.5±41.7)g,雌雄不限,由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證:SCXK(蘇2009-0002),發(fā)證機(jī)關(guān)是江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)。1.2飼養(yǎng)環(huán)境及分組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,再按照體重排序后,將其中72只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為兩組,即假手術(shù)組(SO組)和模型組(M組),每組36只,每組又根據(jù)術(shù)后第1、2、4、6、8、12周的不同時(shí)段分為6個(gè)亞組,每組6只。另6只作為空白對照組(BC組)飼養(yǎng)3個(gè)月。精飼料喂養(yǎng),自由飲用自來水,切口保持干潔,定期碘伏消毒。1.3模型制作M組行左后肢坐骨神經(jīng)切斷術(shù),SO組的手術(shù)過程只分離顯露坐骨神經(jīng)后縫合切口,BC組不作任何處理。1.4檢測項(xiàng)目與方法1.4.1標(biāo)本的獲取M組和SO組分別在術(shù)后第1、2、4、6、8、12周各隨機(jī)取6只大鼠收集晨尿。處死解剖后心臟穿刺抽取血液0.5~1mL,注入離心管,在室溫下靜置2h后,于低速離心機(jī)離心,速度3000r/min,離心5min,留取血清,置冰箱內(nèi)-20℃冷凍保存。1.4.2骨代謝生化指標(biāo)的測定使用全自動(dòng)生化分析儀測定尿肌酐(Cr)、血堿性磷酸酶(ALP),尿羥脯氨酸(HOP)用對二甲氨苯甲醛法測定,血清骨鈣素(BGP)用放射免疫法測定,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)用免疫酶聯(lián)法。1.4.3脛骨組織形態(tài)學(xué)檢測取各組左脛骨近側(cè)干骺段,甲醛固定,EDTA液脫鈣,冠狀對剖,酒精順濃度梯度脫水,組織浸蠟,石蠟包埋,5μm切片,HE染色和Masson染色,鏡下觀察股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨組織形態(tài)改變。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,所有數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗(yàn),呈正態(tài)分布數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1手術(shù)切口紅外觀大鼠實(shí)驗(yàn)中無動(dòng)物意外死亡,觀察各時(shí)間段內(nèi)大鼠體重增長基本正常。部分大鼠手術(shù)切口紅腫,經(jīng)消毒等處理后愈合良好。M組大鼠造模后即出現(xiàn)患肢跛行,至處死仍不能恢復(fù),但均可以3個(gè)肢體行走及正常覓食。SO組術(shù)后1周內(nèi)即可恢復(fù)4個(gè)肢體行走及正常覓食。2.2不同時(shí)期血alp、bgs、trach和尿丙酮值的測定結(jié)果2.2.1各組小鼠血alp比較隨著去神經(jīng)時(shí)間的延長,M組血ALP逐漸升高,至第8、12周這種升高趨勢變緩。M組各時(shí)段之間血ALP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),M組與BC組間血ALP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SO組與BC組間及SO組內(nèi)各時(shí)段之間血ALP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1周M組與SO組間血ALP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),余各時(shí)段M組與SO組間血ALP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。2.2.2各組各時(shí)段之間血bgp的比較隨著去神經(jīng)時(shí)間的延長,M組血BGP逐漸降低,至第8、12周這種降低趨勢變緩。M組血BGP術(shù)后1、2周與其他時(shí)段之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),術(shù)后4、6、8、12周之間血BGP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),M組與BC組間血BGP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),SO組與BC組間及SO組各時(shí)間段之間血BGP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各時(shí)間段M組與SO組間血BGP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。2.2.3各組血tracp比較隨著去神經(jīng)時(shí)間的延長,M組血TRACP逐漸升高,至第8、12周這種升高趨勢變緩。M組各時(shí)段之間血TRACP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),M組與BC組間血TRACP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SO組與BC組間及SO組各時(shí)段之間血TRACP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各時(shí)段M組與SO組間血TRACP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。2.2.4各組間尿hop/cr的比較隨著去神經(jīng)時(shí)間的延長,M組尿HOP/Cr逐漸升高,至第8、12周這種升高趨勢變緩。M組各時(shí)段之間尿HOP/Cr差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),M組與BC組間尿HOP/Cr差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SO組與BC組間及SO組各時(shí)段之間尿HOP/Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1、2周M組與SO組尿HOP/Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),余各時(shí)段M組與SO組間尿HOP/Cr差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。2.3骨皮質(zhì)與so組觀察的穩(wěn)定性觀察SO組脛骨近側(cè)干骺段骨皮質(zhì)較厚,孔隙較少,骨小梁排列緊密,結(jié)構(gòu)正常,見圖1。而M組骨皮質(zhì)與SO組相比較薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纖細(xì)并有多處斷裂,小梁間吻合減少,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴(kuò)大,破骨細(xì)胞數(shù)增多,且隨著觀察時(shí)間延長,表現(xiàn)越明顯,見圖2。新生成的膠原經(jīng)Masson染色為綠色,可見隨著廢用時(shí)間的延長,新生膠原的量也在減少,見圖3。3骨組織模型的建立廢用性骨質(zhì)疏松是由于各種原因?qū)е轮w制動(dòng)、全身不活動(dòng)或者失重以后,體內(nèi)骨形成和骨吸收的平衡被打亂,成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨形成減低,而破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng),導(dǎo)致局部性或者全身性骨量減低和骨的力學(xué)性能顯著降低,患者的骨折發(fā)生率顯著增高。骨形成的指標(biāo)有血清總ALP和BGP,骨吸收的指標(biāo)有TRACP和尿HOP/Cr。當(dāng)骨形成與骨吸收偶聯(lián)時(shí),BGP是反映骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo),而當(dāng)骨形成與骨吸收解偶聯(lián)時(shí),BGP是反映骨形成的特異指標(biāo),BGP作為直接反映骨形成的特異性指標(biāo),可用來監(jiān)測骨質(zhì)疏松和判斷其他代謝性骨病治療效果。血清ALP包括總ALP和骨ALP,在沒有肝臟疾病的情況下,血中ALP含量的變化大致反映骨代謝變化的程度,但對骨組織而言缺乏特異性。骨源性酸性磷酸酶能抵抗酒石酸的抑制,故而稱之為TRACP,血液TRACP主要來源于骨吸收過程中破骨細(xì)胞的釋放,TRACP的活性與骨吸收狀況相平行。尿HOP主要反映骨組織膠原代謝的變化,在無明顯的皮膚疾病和其他結(jié)締組織疾病時(shí),尿HOP在很大程度上反映骨代謝的改變,研究表明,尿HOR/Cr比值與骨吸收呈顯著正相關(guān),可以將尿HOR/Cr比值的水平作為衡量骨有機(jī)質(zhì)吸收的重要生化指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,造模術(shù)后各時(shí)間M型組直接反映骨形成的特異性指標(biāo)BGP顯著性降低,反映骨內(nèi)膠原代謝變化的指標(biāo)HOP/Cr顯著性增加,血清ALP顯著升高,一定程度上揭示骨轉(zhuǎn)換率及骨形成明顯增加,血清TRACP顯著升高,標(biāo)志著骨吸收增加。骨組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)M組骨皮質(zhì)與SO組相比較薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纖細(xì)并有多處斷裂,小梁間吻合減少,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴(kuò)大,破骨細(xì)胞數(shù)增多,新生膠原的量也在減少,且隨著觀察時(shí)間延長,表現(xiàn)越明顯。這些指標(biāo)的改變表明廢用性骨質(zhì)疏松的大鼠模型建立成功。目前復(fù)制廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型所采用的動(dòng)物和方法較多,其中以大白鼠最為常用,BARON等認(rèn)為,12周左右的大鼠其二級松質(zhì)骨的重建酷似人類骨骼,因此以研究人類為目的而以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强尚械摹Ｅc其他模型比較,失神經(jīng)引起的局部骨質(zhì)疏松在本質(zhì)上更接近于臨床上所見到的廢用性骨質(zhì)疏松。但查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)采用大鼠失神經(jīng)造模后發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松的時(shí)間段并不一致,以及通過此造模方法觀察廢用性骨質(zhì)疏松最佳時(shí)間段未見相關(guān)報(bào)道。ZENG等報(bào)道失神經(jīng)后骨形成下降,骨吸收增加,骨丟失在術(shù)后10~42d達(dá)高峰,并在X線片上有反映。SHVETS等將體重為200~230g的Wistar雄性大鼠限制于小型籠具內(nèi)60d誘發(fā)骨質(zhì)疏松。TUUKKONEN等應(yīng)用石膏固定重200gSD雄性大鼠的單側(cè)后肢2周,發(fā)現(xiàn)被固定測脛骨的灰重丟失10.7%,同時(shí)鈣與骨的結(jié)合被顯著抑制,血清ALP的活性明顯降低。唐學(xué)陽等將4周齡SD雄性大鼠通過腿-尾固定法制動(dòng)2周和4周后發(fā)現(xiàn)股骨濕重、灰重、股骨和脛骨骨密度均顯著低于對照組,脛骨近側(cè)干骺端骨組織成骨細(xì)胞胞漿和核膜維生素D表達(dá),制動(dòng)后表達(dá)增強(qiáng)。大鼠后肢制動(dòng)2周后,右后肢脛骨近側(cè)干骺端的骨小梁面積約為同齡對照組的68.2%,骨小梁周長約為同齡對照組的76.8%;在制動(dòng)4周后,右后肢脛骨近側(cè)干骺端的骨小梁面積僅約為同齡對照組的28.8%,骨小梁周長則約為同齡對照組的39.4%,與制動(dòng)2周時(shí)相比,隨著制動(dòng)時(shí)間的延長,兩者均有明顯下降。本研究中,M組術(shù)后1、2周與其他時(shí)段之間血BGP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),術(shù)后4、6、8、12周之間血BGP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);且從術(shù)后第4周開始