不同負(fù)荷訓(xùn)練對大鼠骨骼肌肌萎縮恢復(fù)的影響

不同負(fù)荷訓(xùn)練對大鼠骨骼肌肌萎縮恢復(fù)的影響

1其他肌肉營養(yǎng)因子四肢鎖、長期臥床、老齡化、體格檢查、糖尿病、癌癥和腎衰竭等疾病將導(dǎo)致骨瘦如骨肌肉消耗和肌肉萎縮。肌肉組織的狀態(tài)變化會影響機(jī)器信號的產(chǎn)生，改變遺傳因子的有效表達(dá)。胰島素樣生長因子-I(Insulin-likegrowthfactor-I,IGF-I)是一種高效能肌肉營養(yǎng)因子。已確認(rèn)除傳統(tǒng)的內(nèi)分泌式功能外,IGF-I還具有獨(dú)立于GH之外的自分泌/旁分泌式局部作用,并在骨骼肌運(yùn)動適應(yīng)變化中具有重要意義。早已證實(shí)肌負(fù)荷增加引起骨骼肌肥大會伴隨肌內(nèi)IGF-ImRNA升高。為進(jìn)一步澄清IGF-I在肌體積調(diào)節(jié)中的作用,本實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)水平檢測了肌活動減少即去負(fù)荷及小強(qiáng)度耐力性恢復(fù)訓(xùn)練中IGF-I多肽水平的變化,以期了解骨骼肌感應(yīng)重力缺失發(fā)生肌萎縮的機(jī)制及相應(yīng)的有效措施。2研究對象和方法2.1大鼠ueldf純種健康雌性Sprague-Dauley(SD)大鼠30只,體重186±9.4g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,稱重后隨機(jī)分為兩組:正常對照組(C,n=7);去負(fù)荷4周組(u,n=23)。u組,參照并改進(jìn)Awede等去負(fù)荷(unloading)模型:透氣式膠布綁縛大鼠兩后肢,使失去活動能力;鼠尾基部剔毛后,敷上薄層窄條紗布0.5cm×2cm,再由1cm×10cm透氣膠布纏繞多圈制成懸掛點(diǎn),連接可裝卸式鏈條吊起,鏈條另一端固定于籠頂合適部位,以使后肢懸垂剛剛脫離地面,身體長軸與水平成25°～30°角,前肢著地仍可自由旋轉(zhuǎn)及自由進(jìn)食飲水。去負(fù)荷4周末,u組再次稱重后隨機(jī)分為3組:去負(fù)荷4周組(U);去負(fù)荷4周后自然恢復(fù)組(UC);去負(fù)荷4周后運(yùn)動恢復(fù)組(UE)。UC組解吊后,標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠內(nèi)普通飼養(yǎng)。UE組采用段氏PT98型鼠類跑臺,參照Bedford大鼠運(yùn)動負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn),制定低強(qiáng)度長時間運(yùn)動模型。共訓(xùn)練4周,每周休息一天,訓(xùn)練6天:速度18m/min,坡度0°(相當(dāng)于45%～50%V02max);每日早8點(diǎn)、晚8點(diǎn)開始,30min/次。2.2學(xué)習(xí)方法2.2.1大、大鼠麻醉、1.4%多聚甲醛-0.5mol/l磷酸緩沖液緩沖液ph7.3去負(fù)荷4周末(C組、U組)、去負(fù)荷后恢復(fù)4周末(UC組、UE組),戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔麻醉、肝素-4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.3)灌注處死大鼠。迅速取出比目魚肌(Soleus,SOL)經(jīng)預(yù)冷滅菌生理鹽水、濾紙?zhí)幚?稱重后標(biāo)記,投入新鮮配置4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.3)后固定(<24h)。2.2.2多聚-l-硫酸溶液的制備載玻片以清潔液清洗干凈后,置入重鉻酸鉀濃硫酸液中浸泡24h,其后流水漂洗過夜(充分洗凈),再蒸餾水漂洗兩遍,置入95%酒精浸泡12h,取出裝盤烘干。取多聚-L-賴氨酸1份,蒸餾水9份,混合均勻。將預(yù)先洗凈、干燥的玻片浸泡于稀釋后的多聚-L-賴氨酸溶液中,提拉十次,瀝干,45℃烤箱烘干后備用。2.2.3水煮時間的確定組織修塊后梯度酒精脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋、修塊、標(biāo)記、切片(切片厚5mm)。58°C烤片18h后,常規(guī)脫蠟至水,分別進(jìn)入IHC和HE染色。顯微圖像電腦分析系統(tǒng)對肌纖維截面積(Cross-sectionalarea,CSA)、肌組織IGF-I多肽含量進(jìn)行相對定量分析。2.2.4統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,經(jīng)SPSS軟件包統(tǒng)計(jì)處理。組間比較采用t-檢驗(yàn),p<0.05有顯著性差異;p<0.01有高度顯著性差異。3結(jié)果與分析3.1關(guān)于igf-i在肌組織相關(guān)研究中的作用失重對骨骼肌的影響相當(dāng)廣泛,導(dǎo)致肌萎縮主要表現(xiàn)在兩個方面:肌肉重量下降、體積減少、肌纖維直徑縮小,以及慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)化,主要是I型肌纖維向IIa、IIx型肌纖維轉(zhuǎn)換。因而本研究選擇骨骼肌濕重和CSA作為去負(fù)荷模擬失重模型中及不同恢復(fù)方式中肌纖維變化的組織學(xué)指標(biāo),并以CSA變化更為可靠。表1所示,與對照組相比,去負(fù)荷4周SOL濕重、CSA分別下降24.06%和38.90%(p<0.01),表明骨骼肌絕對重量與截面積明顯下降,去負(fù)荷4周對肌肉系統(tǒng)有顯著影響;同時反映實(shí)驗(yàn)成功地建立了吊尾模擬失重使骨骼肌萎縮的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?與其他失神經(jīng)、制動等萎縮模型變化趨勢相似。目前,隨著IGF-I局部自分泌/旁分泌功能的發(fā)現(xiàn)及在傳統(tǒng)內(nèi)分泌中的重要作用,使其在肌組織的相關(guān)研究中更加備受關(guān)注。多數(shù)研究已確認(rèn)多種方式應(yīng)用超量IGF-I可通過抗凋亡、增加蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)降解等途徑有效地緩解骨骼肌萎縮,另有研究提出局部肌型IGF-I可能在臨床預(yù)防年齡相關(guān)的肌萎縮中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,去負(fù)荷4周SOL廢用性萎縮的同時IGF-I多肽含量也顯著下降31.99%(p<0.05);另外,Adwede等報(bào)道去負(fù)荷2天即可見SOLIGF-ImRNA顯著減少達(dá)30%。可能去負(fù)荷4周,引起骨骼肌活動急劇減少,機(jī)械信號刺激下降而影響IGF-I基因及多肽的有效表達(dá)。提示失重狀態(tài)下IGF-I表達(dá)下降可能引起骨骼肌萎縮,并主要使I類肌纖維萎縮及收縮力減弱,其中可能機(jī)制如下所述。蛋白質(zhì)代謝及酶活性發(fā)生改變:資料表明,IGF-I與受體結(jié)合后,可通過PI-3K路徑激活S6蛋白激酶?；罨腟6蛋白激酶S6K1再使核糖體S6蛋白磷酸化,而增加編碼核糖體蛋白、延伸因子及整個蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)組件的mRNA轉(zhuǎn)錄,并增加多種蛋白激酶以及糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)底酶系統(tǒng)內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,總體表現(xiàn)是增加蛋白質(zhì)合成的同時抑制蛋白質(zhì)降解。而IGF-I水平下降,可能經(jīng)此途徑反向減少肌內(nèi)蛋白含量導(dǎo)致萎縮,主要為早期蛋白質(zhì)合成減少(肽鏈延伸速率變小引起蛋白質(zhì)翻譯量下降)及后期蛋白質(zhì)降解增加(相關(guān)蛋白水解酶活性增加引起無負(fù)荷骨骼肌蛋白質(zhì)降解率增加),無負(fù)荷骨骼肌內(nèi)多種mRNA濃度發(fā)生改變。凋亡:IGF-I還可改變細(xì)胞內(nèi)AKT活性而經(jīng)過依賴(或不依賴)PI-3K路徑發(fā)揮抗凋亡作用。Tews等發(fā)現(xiàn)萎縮骨骼肌細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象,且IGF-I能抑制DNA降解、延緩細(xì)胞凋亡而提高細(xì)胞存活率。Allen等也報(bào)道大鼠懸垂14天雙鏈DAN斷裂及形態(tài)異常的肌核數(shù)即顯著增加,即凋亡能導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞核萎縮和衛(wèi)星細(xì)胞減少,而IGF-I有保護(hù)肌核、抗凋亡功能,去負(fù)荷誘導(dǎo)的IGF-ImRNA瞬時下降可能參與去負(fù)荷誘導(dǎo)骨骼肌萎縮相關(guān)的肌核凋亡。提示IGF-I減少可能增加SOL細(xì)胞凋亡率而加重肌萎縮。3.2骨骼肌負(fù)荷狀態(tài)變化對免疫反應(yīng)的影響和去負(fù)荷4周組相比,去負(fù)荷后運(yùn)動恢復(fù)組和自由恢復(fù)組SOL濕重上升(p<0.01);肌截面積變化有一定區(qū)別,運(yùn)動恢復(fù)SOLCSA增加110.81%(p<0.01)而自然恢復(fù)CSA上升67.37%(p<0.05)。提示運(yùn)動使SOLCSA增加更顯著,這與以往理論保持一致,小強(qiáng)度耐力練習(xí)中主要是慢肌群參與并得到鍛煉。另外,運(yùn)動恢復(fù)使SOLIGF-I也明顯增加達(dá)87.58%(p<0.01);自由恢復(fù)組增加53.10%(p<0.05)。骨骼肌負(fù)荷狀態(tài)變化刺激肌體積發(fā)生適應(yīng)性改變,主要體現(xiàn)在肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成/降解及肌內(nèi)肌核數(shù)量的變化。實(shí)驗(yàn)中小強(qiáng)度耐力負(fù)荷可能通過增加機(jī)械信號,刺激SOL合成、IGF-I分泌顯著增加。而IGF-I除前述能刺激肌纖維合成代謝過程外,作為旁分泌生長因子,可激發(fā)臨近衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期發(fā)生增殖,作為自分泌生長因子又可通過MAPK途徑促有絲分裂,增加肌內(nèi)肌核數(shù)量以保持恢復(fù)后肌核與肌纖維大小之比。也有報(bào)道IGF-I可減少細(xì)胞循環(huán)抑制因子p27Kipl,通過PI3K/Akt路徑增加肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。另有關(guān)自由恢復(fù)組IGF-I表達(dá)顯著增加,這可能與SD大鼠本身生活習(xí)性有關(guān)。日常攝食、抓爬鐵籠、相互廝打等多種行為及夜間活動非?；钴S的特點(diǎn)使自由恢復(fù)組大鼠也從事了一定的耐力運(yùn)動。因而提示小強(qiáng)度耐力性等張練習(xí)使慢肌更好恢復(fù)可能與內(nèi)源性IGF-I多肽表達(dá)增加有關(guān)。雖然上述耐力運(yùn)動使SOL肌肉濕重、CSA及IGF-I含量的增加有優(yōu)于自由恢復(fù)組的趨勢,但變化顯示UE、UC組間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),與金真等報(bào)道等張運(yùn)動鍛煉在抗肌萎縮中無顯著作用觀點(diǎn)一致,本實(shí)驗(yàn)中該運(yùn)動形式在此方面亦未見有顯著作用。提示實(shí)踐中小強(qiáng)度耐力運(yùn)動雖對機(jī)體有一定鍛煉意義,但可能并不是對抗肌萎縮的最適合練習(xí)方法。反而抗阻訓(xùn)練、被