植酸酶在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用

植酸酶在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用

植物酶是一種能夠分解植物含有水分和酸鹽的磷酸酶。它能將植酸水解成肌醇和無機(jī)磷酸,供有機(jī)體利用。目前主要用作飼料添加劑,增加動物對礦物質(zhì)的利用,促進(jìn)動物的生長發(fā)育,降低磷的排放量。目前,植酸酶已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn),但是在植酸酶的推廣應(yīng)用中還存在一些問題,其中較為突出的是植酸酶的熱穩(wěn)定性問題。飼料生產(chǎn)中的制粒過程需要經(jīng)過高溫加熱,一般在75℃～80℃,同時為了殺死沙門氏菌,有時溫度高達(dá)85℃～90℃,植酸酶在這樣的溫度下很容易失活,通?；钚越禐樵瓉淼?0%,甚至更低。所以,進(jìn)一步篩選耐熱性更好的植酸酶以及探索更好的提高植酸酶的熱穩(wěn)定性的方法仍是研究的重點。植酸酶廣泛存在于植物、動物及微生物中。目前對植酸酶的研究集中在產(chǎn)酶菌種的篩選、酶基因的克隆表達(dá)和酶蛋白的人工改造及與這些內(nèi)容相關(guān)的性質(zhì)研究和利用方面。1其他方面的研究進(jìn)展從1907年發(fā)現(xiàn)第一個植酸酶至今,人們已經(jīng)從酵母菌、曲霉、青霉、隔孢伏革菌、假單孢菌、枯草桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌等菌種,以及玉米、番茄、麥麩等植物性產(chǎn)物中分離得到多種植酸酶或有植酸酶效應(yīng)的磷酸酶類。據(jù)美國國家圖書館官方網(wǎng)站PubMed統(tǒng)計,目前注冊的植酸酶蛋白序列已有近200種。雖然其中包括了許多人工改造過的酶蛋白,但大部分都是從自然界發(fā)現(xiàn)的,除此之外還不斷有新的天然酶被發(fā)現(xiàn)。如近來在青霉菌、酵母、乳酸菌、芽孢桿菌、大腸桿菌、豆類植物等生物體中又發(fā)現(xiàn)了很多有前景的天然植酸酶。尤其是芽孢桿菌植酸酶具有近乎中性的最適pH值,酶活性高,熱穩(wěn)定性好,可廣泛應(yīng)用于魚類飼料。大腸桿菌植酸酶良好的熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性也深受人們關(guān)注。由于產(chǎn)植酸酶的天然株大都表達(dá)量低,在篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)酶的過程中人們對多種植酸酶基因進(jìn)行了重組表達(dá)。如首次在真菌中分離出的6-植酸酶(EC3.1.3.26)基因在Aspergillusoryzae中得到重組表達(dá)。姚斌等將Bacillussubtilis的中性植酸酶基因nphy在E.coli中高效表達(dá),獲得了有正常的生物學(xué)活性的重組酶。Aspergillusfumigatus的植酸酶基因在A.nigerNW205中表達(dá)后,獲得的重組酶在100℃下加熱20min后,酶活僅損失10%,有很好的熱穩(wěn)定性。目前應(yīng)用最廣的植酸酶基因是來源于無花果曲霉A.ficuum-NRRL3135的phyA基因,它已在多個表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)植酸酶phyA。重組表達(dá)技術(shù)與分離篩選技術(shù)相結(jié)合促進(jìn)了人們對各種植酸酶性質(zhì)的研究。2熱穩(wěn)定性測定植酸酶制劑的熱穩(wěn)定性與植酸酶本身的熱穩(wěn)定性密切相關(guān),因此獲得熱穩(wěn)定性高的植酸酶可以大大提高酶制劑的熱穩(wěn)定性?，F(xiàn)選取部分植酸酶,將其熱穩(wěn)定性狀況列于表1,以便于比較。表1中Aspergillusfumigatus和Thermomyceslanuginosus植酸酶的熱穩(wěn)定性最好,有一定發(fā)展前景,但可以看到大部分熱穩(wěn)定性好的植酸酶的最適酶促反應(yīng)溫度也偏高,而最適酶促溫度接近40℃的植酸酶則熱穩(wěn)定性較差,所以目前還有必要繼續(xù)尋找更高耐熱性且最適酶促溫度接近40℃的優(yōu)質(zhì)植酸酶,以促進(jìn)植酸酶的普遍推廣使用。3保護(hù)劑、酶和生物活性酶對溫度的敏感性不但與酶蛋白分子本身的結(jié)構(gòu)有關(guān),也與一系列條件有關(guān)。比如,酶的濃度、純度、有無底物和保護(hù)劑的存在、介質(zhì)的pH值、離子強(qiáng)度等。植酸酶的熱穩(wěn)定性工程技術(shù)的研究也主要是從這些方面入手的。3.1通過改變酶分子的結(jié)構(gòu)，提高耐寒性3.1.1重組phy基因的糖基化表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)合成有復(fù)雜的翻譯后修飾過程,對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的性能有重要作用。由于翻譯后修飾的細(xì)微差異,同樣的菌種同樣的基因,不同的分離菌株中表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)也會出現(xiàn)一些差異。翻譯后修飾中最主要的是糖基化修飾。為了檢驗糖基化程度對植酸酶分子熱穩(wěn)定性的影響,HanYanming等把A.nigerphyA基因在P.pastoris中表達(dá),重組phyA的分子量變?yōu)?5kD,比A.niger天然表達(dá)的phyA的分子量(80kD)大19%,在糖基化水平上略有提高,最適溫度變?yōu)?0℃,比原酶的最適溫度58℃提高2℃。通過一定的方法去糖基化后,酶分子量減為55kD,同時熱穩(wěn)定性也降低34%。設(shè)計新的表達(dá)載體使phyA基因在Saccharomycescerevisiae中表達(dá),由于S.cerevisiae表達(dá)系統(tǒng)的高度糖基化作用,重組酶的分子量達(dá)到120kD,比A.niger天然表達(dá)的phyA的分子量大50%。重組酶的最適酶促反應(yīng)溫度55℃～60℃,比原酶的范圍更寬;未完全純化的重組酶在55℃與80℃下分別作用15min之后,酶活分別保留95%和75%,而同樣條件作用后的商品酶PhyA酶活保留分別為72%和51%。該重組phyA經(jīng)去糖基化后,酶活只降低了9%,但酶的熱穩(wěn)定性大為降低,80℃加熱15min,酶活損失40%。去糖基化后的分子量變?yōu)?0kD,與由其他宿主系統(tǒng)表達(dá)的基因相同但耐熱性差的r-phyA的分子量相似。充分說明了糖基化程度對該酶熱穩(wěn)定性的重要影響。3.1.2采用蛋白質(zhì)工程方法改造酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)(1)突變體基因在p.pastoris中表達(dá)Rodriguez等對E.colipH2.5酸性磷酸酶進(jìn)行定點突變,用天冬氨酸替代酶蛋白多肽鏈中的幾個氨基酸殘基,增加酶分子潛在的糖基化位點的數(shù)目。突變體基因在P.pastoris中表達(dá),得到了糖基化程度、酶活性及熱穩(wěn)定性改變很大的突變體植酸酶。近年來的研究也表明,單一氨基酸的替換可以改變酶蛋白的熱穩(wěn)定性,尤其是Pro殘基對改善熱穩(wěn)定性的作用尤為顯著,可以作為植酸酶蛋白改造的一個思路。(2)改變基因型的表達(dá)系統(tǒng),增加穩(wěn)定性的基因組織的方案“一致性技術(shù)(consensustechnique)”于1998年由Lehmann采用,用于創(chuàng)造新的植酸酶分子。其方法是將已知的PhyA的氨基酸序列放在一起比較,借助計算機(jī)的幫助,從中選擇對每一個氨基酸位點最保守的殘基,拼成序列,然后將最后確定的氨基酸序列翻譯成相應(yīng)的DNA序列,再選用合適的表達(dá)系統(tǒng)對這個“人造的”目的基因進(jìn)行表達(dá)。他們以13個有一定同源性的已知植酸酶序列作為母本,用該技術(shù)創(chuàng)造出了一種新植酸酶(phyA-1),這種酶的熱解鏈溫度比它的13個母本平均提高了15～22℃,而它在37℃的酶活性則與通常的天然植酸酶相當(dāng)。2002年,Lehmann等為該技術(shù)提出了新的證據(jù)。在以前13個植酸酶序列的基礎(chǔ)上,增加6個植酸酶的序列進(jìn)行一致性技術(shù)構(gòu)造,得到的新酶phyA-10比以前得到的phyA-1的熱穩(wěn)定性提高了7.4℃。對phyA-10中4個不穩(wěn)定性氨基酸進(jìn)行回復(fù)突變,并且引入一個新的穩(wěn)定性氨基酸殘基,使phyA-10的熱穩(wěn)定性從85.4℃進(jìn)一步提高到90.4℃。通過定點突變逐個檢測每個氨基酸殘基對熱穩(wěn)定性提高的貢獻(xiàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)交換的38個殘基中每一個氨基酸殘基單獨對熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)都小于3℃,整體上熱穩(wěn)定性的提高是這些對該蛋白有穩(wěn)定作用的氨基酸共同作用的結(jié)果,說明一致性概念在蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性工程中是有通用性的。(3)新酶的熱穩(wěn)定性Jermutus等按照耐熱性較好的A.niger植酸酶的晶體結(jié)構(gòu),將Aspergillusterreus植酸酶表面的一個二級結(jié)構(gòu)α-螺旋用A.niger植酸酶上相應(yīng)長度的一段序列替換,獲得了酶活性未變而熱穩(wěn)定性提高的新植酸酶。盡管新酶中只有A.niger植酸酶31個氨基酸序列,但新酶的熱穩(wěn)定性與A.niger植酸酶相似。說明這種熱穩(wěn)定性一定程度上是該二級結(jié)構(gòu)作用的結(jié)果。相對于隨機(jī)突變的大量篩選而言,該方法省去了篩選的繁重工作,可作為酶定向進(jìn)化的候選方法之一。(4)revi蝦bdi291黃遵錫等將A.ficuumNRRL3135植酸酶基因的+159～+662位點之間的503bp長度的功能區(qū)域在SaccharomycescerevisiaeBJI991中表達(dá)。獲得的新植酸酶的最適酶促反應(yīng)溫度也是55℃,但耐熱性大為下降,80℃作用2min后,殘余酶活7%,原始菌株產(chǎn)生的植酸酶80℃處理2min后,殘余酶活11%。該結(jié)果一方面說明該區(qū)域是植酸酶的酶催化活性功能區(qū),另一方面,新酶對溫度的敏感性則說明沒有表達(dá)的那段多肽對整個蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性是起重要作用的。該方法雖然沒有使植酸酶的熱穩(wěn)定性提高,但是卻對研究進(jìn)一步提高植酸酶的熱穩(wěn)定性有一定的參考作用。3.2改變酶的環(huán)境條件，提高植物酸酶的耐磁性3.2.1抗氧化酶系統(tǒng)目前已經(jīng)研究了很多金屬離子對植酸酶的作用,其中Ca2+對一部分植酸酶的穩(wěn)定性和活性的作用較為顯著,通常情況表現(xiàn)出促進(jìn)作用。如:Kerovuo等研究發(fā)現(xiàn),用EDTA除去枯草芽孢桿菌植酸酶中的金屬離子可使酶完全失活。去金屬酶能在鈣離子存在的條件下部分地恢復(fù)活性構(gòu)象。認(rèn)為B.subtilis植酸酶的活性構(gòu)象維持需要鈣離子的存在,同時Ca2+在抗熱變性方面對該酶有很強(qiáng)的穩(wěn)定性作用。Ha等研究一種新的熱穩(wěn)定性的植酸酶部分或充分結(jié)合Ca2+時的晶體結(jié)構(gòu),也發(fā)現(xiàn)Ca2+對于該酶的活力和熱穩(wěn)定性有重要作用。在Ca2+高親和力結(jié)合位點結(jié)合兩個Ca2+,連接酶分子氨基酸序列上的遠(yuǎn)距環(huán)狀片段,該酶的熱穩(wěn)定性顯著提高(使熱變性溫度提高了30℃)。3.2.2植酸酶的固定化固定化酶廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和研究領(lǐng)域,可以大大提高酶的穩(wěn)定性。已有研究人員在嘗試植酸酶的固定化應(yīng)用,用來制備肌醇多磷酸的系列化合物。以植酸酶為標(biāo)志酶,還發(fā)展出了通用于真菌來源的酶的新的固定化技術(shù)。固定化植酸酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性大為提高,是植酸酶利用的方向之一。3.2.3殘留酶活性和保護(hù)劑的添加量在熱處理中所使用的緩沖液可以調(diào)節(jié)酶的熱穩(wěn)定性。重組表達(dá)的A.fumigatus植酸酶經(jīng)高溫處理后,在10mmol/L和200mmol/L的醋酸鈉溶液中比在檸檬酸溶液中的殘留酶活性可以高20%～39%。另外,保護(hù)劑的添加也會大大增加酶的熱穩(wěn)定性,例如有機(jī)溶劑甘油、蔗糖、乙二醇溶液等。國外生產(chǎn)者已成功地選擇適宜的無機(jī)鹽種類和濃度以及合適的保護(hù)劑來提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。3.3包被型飼用植酸酶目前,植酸酶產(chǎn)品主要有粉劑和膠囊顆粒兩種類型。避免熱處理酶活損失的方法之一是采取在制粒后進(jìn)行液體噴涂的方式添加植酸酶。1996年,歐洲著名的酶制劑生產(chǎn)商N(yùn)OVO和BASF公司采用的包被型飼用植酸酶的生產(chǎn)工藝,雖然生產(chǎn)成本較高,但卻使商業(yè)化生產(chǎn)的植酸酶的熱穩(wěn)定性得到大幅度的提高,經(jīng)調(diào)質(zhì)溫度85℃處理30S,酶活性保留率達(dá)到70%左右。所以從生產(chǎn)工藝上提高植酸酶熱穩(wěn)定性可發(fā)掘的潛力還很大。4不同高溫對酶活力的影響雖然在提高植酸酶的熱穩(wěn)定性方面,人們已經(jīng)嘗試使用了各種方法,并取得了很大的進(jìn)步。但是仍然有一個最大的問題沒有解決,這就是高溫下的熱穩(wěn)定性與畜禽體溫37℃～40℃條件下酶的活力水平的