牙周袋齦下菌斑中古細(xì)菌分布的基因組學(xué)分析

牙周袋齦下菌斑中古細(xì)菌分布的基因組學(xué)分析

每周疾病是由微生物引起的感染疾病。牙菌斑的研究一直是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前已知牙菌斑中生存著超過(guò)600種的微生物物種。依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)的傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法,對(duì)于其中的苛養(yǎng)細(xì)菌和未知培養(yǎng)方法的微生物,往往無(wú)能為力。因此牙菌斑中半數(shù)以上的微生物由于未獲培養(yǎng)而不為人們所了解,嚴(yán)重地局限了人們對(duì)牙菌斑微生物的全面認(rèn)識(shí),而未知的牙周病病原微生物可能涵蓋真菌、病毒、未獲培養(yǎng)的細(xì)菌和古細(xì)菌等眾多微生物。古細(xì)菌又稱(chēng)古菌(Archaea,舊稱(chēng)Archaeobacteria),廣泛分布于高溫、高酸堿度、高鹽濃度、嚴(yán)格無(wú)氧狀態(tài)等各種極端自然環(huán)境中。針對(duì)古細(xì)菌的醫(yī)學(xué)研究相當(dāng)有限,因此古細(xì)菌與人類(lèi)疾病的關(guān)系非常模糊。雖然近來(lái)的研究已經(jīng)證實(shí)人體內(nèi)的許多環(huán)境是適合古細(xì)菌生存的,但還沒(méi)有確鑿的證據(jù)證實(shí)古細(xì)菌與人類(lèi)疾病的因果關(guān)系,在牙周病學(xué)領(lǐng)域的研究更少。本研究使用非培養(yǎng)依賴(lài)的分子生物學(xué)技術(shù),以獲取齦下菌斑中古細(xì)菌分布的基線信息,為探索古細(xì)菌與牙周疾病的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。1對(duì)象和方法1.1測(cè)量不同深度牙周袋的蝦下菌斑標(biāo)本的采集經(jīng)知情同意,由牙周科門(mén)診隨機(jī)入選牙周炎和牙齦炎患者作為采樣對(duì)象,采集不同深度牙周袋(齦袋)的齦下菌斑標(biāo)本。被采集標(biāo)本的患者均否認(rèn)有系統(tǒng)性疾病史,均否認(rèn)3月內(nèi)有服用抗生素史,女性患者均否認(rèn)妊娠。1.2離心管菌斑的采集在臨床治療前,檢查記錄患者基本信息。隨機(jī)選擇標(biāo)本采集位點(diǎn),記錄采集位點(diǎn)的牙周袋或齦袋探診深度(probedepth,PD)等檢查資料,刮除齦上菌斑,使用無(wú)菌Gracey刮治器刮取齦下菌斑,立即轉(zhuǎn)入含0.3mLPBS的離心管中,使用電子天平檢測(cè)離心管質(zhì)量變化,計(jì)算采集到的菌斑數(shù)量,振蕩5min,從中抽取含有1mg菌斑的液體至一新的無(wú)菌離心管,-20℃凍存。1.3各組pd2mm依據(jù)上述臨床數(shù)據(jù)將牙周袋位點(diǎn)按照PD分為A組(PD≤2mm,n=13)、B組(PD=3～4mm,n=15)、C組(PD=5～6mm,n=19)和D組(PD≥6mm,n=22)。1.4離心除雜與澄清收集得到的標(biāo)本加入0.3mLDNAzol(Invitrogen),振蕩1min,10000×g離心10min,吸取上清液至新管中,加入無(wú)水乙醇0.15mL,振蕩混合后靜置3min,4000×g離心2min,棄上清。加入0.3mL75%乙醇洗滌2遍。棄上清后靜置2min,加入0.2mL8mmol/LNaOH溶液振蕩溶解DNA。1.5反應(yīng)條件及pcr擴(kuò)增能力nf①設(shè)計(jì)合成引物:引物1:AGCRRGAGCCCGGAGATGG;引物2:CGGCGTTGARTCCAATTAAAC。②PCR反應(yīng)體系(20μL):10×PCR緩沖液2.5μL,Mg2+終濃度1.5mmol/L,10mmol/LdNTP0.5μL,5U/μLExTaq(Takara)0.1μL,25mmol/L引物各0.25μL,模板1μL,去離子水加至20μL。③PCR儀(Biometra)設(shè)定反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性60s;95℃變性15s、64℃退火30s,40個(gè)循環(huán);附加72℃延伸7min。④擴(kuò)增產(chǎn)物獲得:擴(kuò)增產(chǎn)物使用含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠電泳40min(恒壓6V/cm),紫外燈觀察目標(biāo)片段,記錄標(biāo)本的陽(yáng)性結(jié)果。1.6單菌落的制備古細(xì)菌通用引物PCR產(chǎn)物為多種序列混合物,使用TA克隆和序列分析進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Takara)回收純化1個(gè)標(biāo)本的PCR產(chǎn)物,取1μL回收DNA片段,加入pMD18-T質(zhì)粒1μL、去離子水3μL、LigationMix試劑5μL,16℃反應(yīng)30min。加入100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30min,42℃加熱45s,再在冰中放置1min。隨后加入890μLSOC培養(yǎng)液,37℃220r/min振蕩培養(yǎng)60min。取100μL鋪于含1mg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上,無(wú)菌L棒涂布均勻,37℃孵育24h,隨機(jī)挑取形成的單菌落25個(gè),接種LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)24h。以菌液為模板重復(fù)上述PCR檢測(cè),將陽(yáng)性的23個(gè)菌液標(biāo)本送商業(yè)公司使用M13引物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果序列使用NCBI提供的Blast以及核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)RDP-Ⅱ的功能進(jìn)行分析和驗(yàn)證,并使用MEGA3軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),參數(shù)bootstrap為500次重復(fù),對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。1.7統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算各組的古細(xì)菌檢出率。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2n-fmoc3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆轉(zhuǎn)化載體菌后測(cè)序,其中1個(gè)序列為部分人和部分古細(xì)菌基因的混合片段,考慮為PCR錯(cuò)誤擴(kuò)增的結(jié)果以剔除,另外4個(gè)信號(hào)較弱無(wú)測(cè)序結(jié)果,其余18個(gè)序列經(jīng)BLAST和RDP-Ⅱ分析,結(jié)果均符合,判斷為古細(xì)菌。MEGA3構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1,編號(hào)S9L-3～S9L-25的序列為本研究測(cè)序結(jié)果(GenBank登錄號(hào)EF432834～EF432851),其余為最近似序列的相關(guān)解釋,刮號(hào)內(nèi)為GenBank登錄號(hào),標(biāo)尺代表0.002進(jìn)化距離。各組臨床標(biāo)本PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2),臨床標(biāo)本中牙周袋較深組(C組或D組)的古細(xì)菌檢出率顯著高于淺牙周袋組(A組或B組)(P<0.01)(表1)。3pcr檢測(cè)及古細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果依據(jù)核糖體RNA基因結(jié)構(gòu),當(dāng)前生物學(xué)領(lǐng)域公認(rèn)的生物分類(lèi)方法將生物分為三個(gè)基本分類(lèi),即真核生物、細(xì)菌和古細(xì)菌。古細(xì)菌的形態(tài)、大小與細(xì)菌類(lèi)似,但結(jié)構(gòu)和生理特性有明顯差異,古細(xì)菌缺少肽聚糖細(xì)胞壁而僅有細(xì)胞膜,而且細(xì)胞膜成份亦不同于真核生物和細(xì)菌,其膜脂由異戊烯醚構(gòu)成;古細(xì)菌DNA復(fù)制機(jī)制與真核生物相似,而與細(xì)菌明顯不同。在本研究中,我們采用分子生物學(xué)方法對(duì)常規(guī)方法可能無(wú)法培養(yǎng)的古細(xì)菌進(jìn)行研究,使用的古細(xì)菌通用引物序列來(lái)自文獻(xiàn)報(bào)道,經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物TA克隆后的測(cè)序,序列經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)Blast分析和系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)比較,判斷擴(kuò)增產(chǎn)物均為古細(xì)菌,并與國(guó)外學(xué)者提交的序列非常接近(>98%),它們的分類(lèi)均歸屬同一“種”水平,證實(shí)了引物的可靠性。在此基礎(chǔ)上,為探索古細(xì)菌與口腔感染性疾病的關(guān)系,本研究使用PCR技術(shù)檢測(cè)齦下菌斑中的古細(xì)菌,分析古細(xì)菌在不同牙周袋深度和附著喪失情況下分布的基線信息,對(duì)不同嚴(yán)重程度的患者和患牙的齦下菌斑標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。將受檢位點(diǎn)按照牙周袋探診深度進(jìn)行分組,計(jì)算各組檢出率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明具有較深牙周袋的C組和D組牙周袋中,古細(xì)菌廣泛分布,其檢出率顯著高于較淺牙周袋的A組和B組(P<0.01)。Kulik等運(yùn)用PCR技術(shù)檢查菌斑DNA,發(fā)現(xiàn)牙周病患者古細(xì)菌感染率為77%。Lepp等在健康對(duì)照組中未檢出古細(xì)菌,而在慢性牙周炎患者患病位點(diǎn)的古細(xì)菌檢出率高達(dá)76.6%,并證實(shí)Methanobrevibacteroralis樣微生物為牙周炎患者齦下菌斑中的主要古細(xì)菌,為此提出假說(shuō)在牙周袋的厭氧環(huán)境中存在微生物相互營(yíng)養(yǎng)的現(xiàn)象,古細(xì)菌在其中扮演某個(gè)角色,對(duì)牙周病的進(jìn)程起到一定的作用。本研究在國(guó)內(nèi)首次在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域探討了古細(xì)菌與人類(lèi)疾病的可能相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌在牙周病患者的牙周袋內(nèi)分布具有特殊