基于改進的融合pcr技術(shù)的同源重組序列構(gòu)建

基于改進的融合pcr技術(shù)的同源重組序列構(gòu)建

隨著大規(guī)模重組計劃的完成和大規(guī)模表達序列標記數(shù)據(jù)庫（dap）的建立，結(jié)果基因組的研究逐漸從結(jié)構(gòu)矩陣轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ芑蚪M的研究。以同源重組技術(shù)為基礎(chǔ),通過構(gòu)建突變或缺失的同源媒介基因載體并取代基因組中野生型的等位基因,進而研究目的基因與表型性狀間的關(guān)系,是研究動物、植物、微生物基因功能的一種非常有用的遺傳操作方法。同源重組的發(fā)生依賴于載體與目的片段間存在一定的DNA序列同源片段,同源片段越長越有利于同源重組事件的發(fā)生。傳統(tǒng)的同源重組載體的構(gòu)建以限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶為基礎(chǔ),通過一系列的酶切連接反應(yīng)將各片段逐步連接起來。這種方法費時費力,不但在連接過程中引入了不必要的酶切位點堿基序列,而且對于長片段的連接有時難以找到合適的酶切位點。為了克服傳統(tǒng)的同源重組載體構(gòu)建方法的缺陷,出現(xiàn)了以聚合酶鏈式反應(yīng)為基礎(chǔ)的片段拼接技術(shù)——融合PCR技術(shù)(fusionPCR)。融合PCR技術(shù)在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下,采用具有互補末端的引物將不同來源的擴增片段連接起來,為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑?，F(xiàn)有的融合PCR技術(shù)一般包括兩步PCR反應(yīng):(1)應(yīng)用特異性引物,對各片段進行獨立擴增,特異性引物的5′末端帶有一段相鄰片段的互補序列;(2)在同一反應(yīng)體系中加入各片段的混合物,以一對外側(cè)引物進行融合片段的全長擴增。由于融合PCR技術(shù)正處于初步發(fā)展階段,在應(yīng)用過程中還存在很多方面的問題,如融合產(chǎn)物長度一般在4.0kb以下、待融合片段的個數(shù)一般不超過3個、產(chǎn)物特異性差等。Robert等應(yīng)用融合PCR方法進行了3個片段的融合反應(yīng),獲得了3個融合產(chǎn)物,融合產(chǎn)物長度最大為4.2kb。Majid等在進行4個片段的連接時,首先將425bp的alcA啟動子片段和1.9kb的pyr4基因片段連接到pUC19載體上,得到一個2.1kb的pyr4-alcA表達盒,再通過兩步PCR將2.1kb的pyr4-alcA表達盒與兩個長度分別為410bp和513bp的片段進行了融合,最終才獲得了一個由4個片段組成的長3.0kb的融合產(chǎn)物。鑒于融合PCR技術(shù)中普遍存在的問題,本研究對現(xiàn)有的融合PCR技術(shù)進行了改進,構(gòu)建了3個同源重組線性DNA片段(Albr和Blhr由3個片段融合而成,Clbrh由4個片段融合而成),并對改進的融合PCR技術(shù)的操作步驟、反應(yīng)條件及技術(shù)要點進行了詳細的論述。與原有的技術(shù)相比,改進的融合PCR技術(shù)增加了一個反應(yīng)步驟,通過3個PCR反應(yīng),在一個反應(yīng)體系中即可以快速實現(xiàn)3個片段和4個片段的融合反應(yīng)。融合產(chǎn)物電泳條帶清晰,產(chǎn)物特異性強,產(chǎn)物的長度分別達到了4.5kb、5.2kb和5.9kb。1材料和方法1.1材料表面1.1.1pcsn43研究哈茨木霉(Trichodermaharzianum)T88菌株、大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、質(zhì)粒pCSN43均由本實驗室保存;質(zhì)粒pBT6購自美國真菌遺傳保存中心(FungalGeneticsStockCenter,FGSC)。1.1.2培養(yǎng)基的制備馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,蔗糖20g,蒸餾水至1000ml;LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g,固體培養(yǎng)基添加15g瓊脂,去離子水至1000ml,固體和液體培養(yǎng)基在使用時按需要加入氨芐青霉素至100μg/ml、X-gal(40μg/ml)、IPTG(10μg/ml)。1.1.3enymemamax和gel花圖PfuDNAPolymerase,LongPCREnzymeMix購自Fermentas公司;GelExtractionMiniKit購自上海華舜生物工程有限公司;pMD18-T載體購自寶生物(大連)有限公司。1.2dna分子手術(shù)基因組DNA的提取、純化,質(zhì)粒DNA的提取、轉(zhuǎn)化均參照文獻。1.3pcr擴增產(chǎn)物本實驗分別構(gòu)建了3個同源重組線性DNA片段(Albr,Blhr,Clbrh),Albr和Blhr由3個片段融合構(gòu)成,Clbrh由4個片段融合構(gòu)成。每個片段的融合反應(yīng)均設(shè)了3次重復,各片段擴增所用引物及序列如表1所示。其中引物Al1、Al2、Ab1、Ab2、Ar1與Cl1、Cl2、Cb1、Cb2、Cr1序列相同,大寫序列為擴增片段的特異性引物序列,小寫序列為相鄰片段的互補序列。1.4擴增條件及產(chǎn)物檢測按照常規(guī)PCR方法進行各目的片段的獨立擴增。擴增使用PfuDNAPolymerase,各片段擴增的反應(yīng)條件及擴增產(chǎn)物長度如表2所示。擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定目的條帶,切膠GelExtractionMiniKit回收。凝膠制備過程中減少EB的加入量,要求EB濃度一般低于0.15μg/ml。1.5ssr-pcr融合dna片段的制備測定各回收產(chǎn)物中目的片段濃度,在50μl體系中加入等摩爾的待融合片段(要求DNA總量不少于800ng),不添加引物,使用PfuDNAPolymerase進行各片段的互補延伸,以形成全長的融合PCR產(chǎn)物(中間產(chǎn)物)。反應(yīng)條件及中間產(chǎn)物長度如表3所示。1.6融合片段的擴增、檢測以中間產(chǎn)物為模板,在50μl體系中依次加入ddH2O,5μl10×LongPCRbuffer(MgCl215mmol/L),2.5μldNTPs10mmol/L,引物各1μl20μmol/L,模板10μl,LongPCREnzymeMix0.5μl,進行融合片段的全長擴增。擴增反應(yīng)條件如表4所示。擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定目的條帶,切膠GelExtractionMiniKit回收。回收產(chǎn)物克隆T載體,藍白斑篩選陽性菌落并菌落PCR鑒定,選取鑒定正確的陽性克隆測序。2結(jié)果2.1哈茨木霉微管蛋白基因下游調(diào)控區(qū)序列及擴增產(chǎn)物的擴增同源重組片段Albr由3個片段融合而成,同源重組左臂Al,選擇標記基因Ab和同源重組右臂Ar,長度分別為1.6kb,2.0kb,1.0kb(圖1a)。其中Al為哈茨木霉β微管蛋白基因上游調(diào)控區(qū)序列;Ab為苯并咪唑抗性基因;Ar為β微管蛋白基因下游調(diào)控區(qū)序列。電泳分析結(jié)果表明,擴增產(chǎn)物長度為4.5kb,與預(yù)期的片段大小相同。產(chǎn)物條帶清晰,特異性強,無其它非特異性條帶產(chǎn)生。實驗設(shè)3次重復,電泳結(jié)果相同,均獲得了目的片段。目的片段經(jīng)回收純化克隆T載體,并挑取陽性克隆進行測序,測序結(jié)果證實了擴增產(chǎn)物的正確性,同源重組片段Albr在擴增過程中無突變發(fā)生。2.2同源重組片段albr-mbr擴增為了明確兩同源臂之間的長度差異是否影響片段間的融合,本實驗進行了Blhr的融合擴增。同源重組片段Blhr由3個片段融合而成,同源重組左臂Bl,選擇標記基因Bh和同源重組右臂Br,長度分別為3.2kb,1.4kb,0.6kb(圖1b)。其中Bl為哈茨木霉β微管蛋白基因編碼區(qū)及上下游調(diào)控區(qū)序列;Bh為潮霉素抗性基因;Br為β微管蛋白下游調(diào)控區(qū)旁側(cè)序列。電泳分析結(jié)果表明,擴增產(chǎn)物長度為5.2kb,與預(yù)期的片段大小相同。產(chǎn)物條帶清晰,特異性強,無其它非特異性條帶產(chǎn)生。所設(shè)3次重復電泳結(jié)果相同,均獲得了目的片段。目的片段的測序結(jié)果證實了同源重組片段Blhr的正確性,擴增過程中無突變發(fā)生。由目的條帶的亮度來看,片段Blhr的產(chǎn)率約為100ng/μl,片段Albr的產(chǎn)率約為400ng/μl。結(jié)果表明,同源重組片段兩同源臂間無論是否存在長度差異,反應(yīng)均可以得到特異性強、含量高的融合產(chǎn)物。2.3擴增產(chǎn)物的擴增同源重組片段Clbrh由4個片段融合而成,同源重組左臂Cl,正選擇標記基因Cb,同源重組右臂Cr和負選擇標記基因Ch,長度分別為1.6kb,2.0kb,1.0kb,1.4kb(圖1c)。其中Cl為哈茨木霉β微管蛋白基因上游調(diào)控區(qū)序列;Cb為苯并咪唑抗性基因;Cr為β微管蛋白基因下游調(diào)控區(qū)序列,Ch為潮霉素抗性基因。電泳分析結(jié)果表明,擴增產(chǎn)物包括3個片段,其中最大的片段長度為5.9kb,與預(yù)期的目的片段大小相同,其余兩個片段長度均在1kb以下,推測為非特異性條帶。所設(shè)3次重復電泳結(jié)果相同,均獲得了目的片段。目的片段的測序結(jié)果證實了同源重組片段Clbrh的正確性,擴增過程中無突變發(fā)生。片段Clbrh的產(chǎn)率約為80ng/μl,與Albr和Blhr的融合反應(yīng)相比,盡管產(chǎn)物得率稍低,且有非特異性片段產(chǎn)生,但通過對目的條帶的純化、克隆,仍然可以得到所需的目的融合片段。3融合pcr技術(shù)本實驗通過對原有融合PCR技術(shù)進行改進,成功地構(gòu)建了3個同源重組線性DNA片段。改進的融合PCR技術(shù)主要包括三個反應(yīng)步驟(圖2):待融合片段的獨立擴增(StepA);各片段間的融合反應(yīng)(StepB),添加第一步反應(yīng)的已純化產(chǎn)物,不添加引物,通過10～13個循環(huán),復性延伸片段之間的重疊部分;對各融合片段的全長擴增(StepC),將第二步反應(yīng)的未純化產(chǎn)物,添加外側(cè)引物進行25～30個循環(huán)。應(yīng)用融合PCR技術(shù)進行片段的連接,操作過程中的注意事項包括:(1)通過引物設(shè)計使待融合片段間形成一定長度的互補區(qū)域,互補區(qū)域的長度取決于待融合片段的長度;擴增片段的特異性引物序列(表1中的大寫序列)要求具有相近的退火溫度。(2)模板量大,要求待融合片段等摩爾混合,并且50μl體系中總DNA量不少于800ng。(3)用于回收待融合片段的凝膠中減少EB的加入量,通常要求濃度低于0.15μg/ml;切膠過程中避免紫外線對模板的直接照射,減少紫外線間接照射時間?？梢钥紤]以PCR產(chǎn)物純化試劑盒代替膠回收試劑盒,避免EB及紫外對模板造成的損傷。(4)融合片段的獲得需要三個步驟的PCR反應(yīng),第一步及第二步PCR反應(yīng)要求使用具有3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶。如果使用的DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3′末端產(chǎn)生polyA尾,當相鄰片段間的互補區(qū)域退火以后,3′末端的polyA尾將阻止延伸反應(yīng)的進行,無法得到全長的融合產(chǎn)物。(5)在使用具有3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶時,為防止引物降解,操作應(yīng)嚴格限制在冰上進行,并推薦使用熱啟動PCR技術(shù)。本研究中通過將配制好的PCR反應(yīng)液從冰上迅速置于預(yù)熱的PCR儀,達到了較好的擴增效果?，F(xiàn)有的融合PCR技術(shù)一般包括兩步PCR反應(yīng),Robert等使用兩步PCR反應(yīng)獲得的3個融合片段,長度分別為4.0kb、4.1kb、4.2kb。Hidekazu等使用同樣的方法進行3個片段的融合反應(yīng),得到的片段長度為4.1kb。除此之外,Hidekazu等對兩步PCR反應(yīng)獲得的融合產(chǎn)物進行電泳分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物條帶背景彌散,并伴有非特異性條帶產(chǎn)生,說明產(chǎn)物特異性較差。改進的融合PCR技術(shù)在原有的兩步反應(yīng)中增加了一個步驟,將各待融合片段等摩爾混合,在不添加引物的條件下先進行11～13個循環(huán),這種方法大大地提高了產(chǎn)物的特異性,減少了非特異性條帶的產(chǎn)生,而且使獲得的融合產(chǎn)物長度高達5.9kb。對于4個片段的連接反應(yīng),除傳統(tǒng)的通過酶切連接的方法將各個片段逐個連接到載體上外,Majid等采用的方法是,首先將兩個片段連接到載體上構(gòu)成一個片段,再將這個片段與另外兩個片段通過兩步PCR反應(yīng)進行融合,這兩種方法都需要限制性酶切位點的存在,費時費力。改進的融合PCR技術(shù)通過三步PCR反應(yīng),可以在一個反應(yīng)體系中實現(xiàn)4個片段的快速融合,大大縮短了反應(yīng)所需時間,降低了反應(yīng)操作難度。本實驗對各融合反應(yīng)均進行了三次重復操作,得到了相同的實驗結(jié)果,表明實驗操作性強,具有可重復性。對各產(chǎn)物的測序結(jié)果均未