基因敲除技術(shù)在工業(yè)微生物代謝工程中的應(yīng)用

基因敲除技術(shù)在工業(yè)微生物代謝工程中的應(yīng)用

生命代謝活動由活細(xì)胞和細(xì)胞組的代謝網(wǎng)絡(luò)操作，后者由一系列特定的酶反應(yīng)和膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)組成。然而,細(xì)胞自身固有的這種代謝網(wǎng)絡(luò)相對于實(shí)際應(yīng)用而言,其遺傳特性通常并非最佳,這就需要對細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行有目的的修飾與調(diào)控。1991年,Bailey和Stephanopoulos在Science上分別發(fā)表重要文章,提出了“MetabolicEngineering”的概念,綜述了代謝工程的應(yīng)用實(shí)例,指出了存在的問題及發(fā)展的方向,被認(rèn)為是代謝工程向一門系統(tǒng)的學(xué)科發(fā)展的起點(diǎn)。簡單地說,代謝工程就是“一種理解并利用代謝過程的方法”;具體而言,代謝工程就是利用基因工程技術(shù)或其他物理、化學(xué)方法對細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行精確地修飾與改造,對細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物質(zhì)的代謝流進(jìn)行擴(kuò)展、減小、阻斷或構(gòu)建新的代謝途徑,從而有目的、有理性地改變微生物原有代謝特性,改進(jìn)或者構(gòu)建新的微生物表型,并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合,提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學(xué)。由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性以及大量生物學(xué)數(shù)據(jù)的未知性,這種以理論為基礎(chǔ)的系統(tǒng)代謝工程方法的應(yīng)用有時(shí)會受到限制。在此條件下,以基因組規(guī)模的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工具為基礎(chǔ)的反向代謝工程方法進(jìn)一步發(fā)展起來。反向代謝工程(Inversemetabolicengineering,IME)的概念最初由JayBailey于1996年提出。首先,識別、構(gòu)建或計(jì)算一種目標(biāo)表型;其次,確定形成該表型的基因或環(huán)境因子;最后,通過直接的基因操作或環(huán)境調(diào)控將該表型轉(zhuǎn)而賦予其他菌株或生物體。簡單而言,反向代謝工程就是從表型到基因型、再從基因型到表型的基因重組策略。無論是代謝工程還是反向代謝工程研究,基因敲除都是代謝途徑調(diào)控的主要方法之一?；蚯贸夹g(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù),是通過一定的方法使細(xì)胞中特定的基因失活或缺失的技術(shù)。它具有定位性強(qiáng)、插入基因隨染色體DNA穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。利用基因敲除技術(shù),不僅可以研究被敲除基因的生物學(xué)功能,還可以進(jìn)行功能基因的插入及染色體基因的替換,進(jìn)而可以阻斷微生物細(xì)胞的代謝旁路,減弱毒/副作用,強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量,從而成為具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物細(xì)胞工廠研究中的重要內(nèi)容。1同源重組的蛋白質(zhì)遺傳重組是指不同DNA配對后的交換和重排過程,包括同源重組、位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組(或異常重組)等。其中,同源重組是指兩個DNA分子之間,通過精確地相互交換片段達(dá)到序列重排的目的。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組(Homologousrecombination)原理,利用限制性內(nèi)切酶、連接酶以及PCR技術(shù)等對線性DNA片段或質(zhì)粒等基因工程載體進(jìn)行改造,并導(dǎo)入目標(biāo)宿主中,使宿主完成對目的基因或基因簇的諸如片段缺失、插入突變、定點(diǎn)突變等一系列的修飾操作。關(guān)于同源重組的分子機(jī)制,目前普遍接受的有3種模型,即Holliday雙鏈侵入模型、MeselsonRadding單鏈侵入模型和Szostak雙鏈斷裂修復(fù)模型。其中,Holliday模型中提出的Holliday連接體(Hollidayjunction)結(jié)構(gòu)是3個模型所共有的重組中間體。越來越多的研究證明,這3種模型實(shí)際上是相互聯(lián)系和相互補(bǔ)充的,而雙鏈斷裂引發(fā)的同源重組是生物體內(nèi)更為普遍的遺傳現(xiàn)象。以大腸桿菌為例,大腸桿菌同源重組過程可分為4個主要階段:起始、同源配對和鏈交換、異源雙鏈擴(kuò)展(分支遷移)以及Holliday連接體的解離。在這一過程中,至少有25種不同的蛋白質(zhì)參與作用。其中,除最基本的DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等之外,具有特殊作用的包括RecBCD、RecA、SSB、RuvAB、RuvC以及順式作用重組熱點(diǎn)χ,也叫Chi位點(diǎn)等,最重要的是RecBCD和RecA蛋白。同源重組的起始最突出的特點(diǎn)就是單鏈DNA的產(chǎn)生,它是同源重組的底物。RecBCD酶是一種多功能的酶,它同時(shí)具有解旋酶、外切核酸酶、單鏈內(nèi)切酶活性,并能以相當(dāng)高的頻率啟動含有Chi位點(diǎn)的DNA重組。Chi位點(diǎn)(5′-GCTGGTGG-3′)天然存在于大腸桿菌的染色體DNA中,約5kb長的序列中出現(xiàn)一次。這些Chi位點(diǎn)與RecBCD酶作用,能夠促進(jìn)具有3′-OH末端的單鏈DNA的產(chǎn)生。如圖1所示,由RecA蛋白促進(jìn)的同源配對和鏈交換是同源重組的核心。RecA蛋白是單鏈結(jié)合蛋白,是同源重組過程中最重要的蛋白質(zhì)之一,它大量地結(jié)合于單鏈DNA上(SSB蛋白輔助),并迅速啟動與之結(jié)合的單鏈DNA尋找同源雙鏈DNA,實(shí)現(xiàn)同源配對。該過程也稱為聯(lián)會(Synapsis)。同源配對后,單鏈DNA便能侵入雙鏈DNA將其中的同源單鏈置換出來,自己與互補(bǔ)鏈進(jìn)行堿基配對,并產(chǎn)生D-環(huán),最終形成Holliday連接體;繼而產(chǎn)生異構(gòu)化,形成異源雙鏈。在RuvA、RuvB以及RuvC等蛋白的參與下,異源雙鏈的擴(kuò)展以及Holliday連接體的解離順利完成,通常會產(chǎn)生兩側(cè)基因有交換以及兩側(cè)基因無交換這兩種結(jié)果。經(jīng)典的基因敲除策略正是利用上述同源重組基本原理,通過體外改造一定長度/形式的基因,與細(xì)胞染色體上的靶基因發(fā)生同源重組(插入或置換),從而改變細(xì)胞的遺傳特性。2環(huán)形質(zhì)粒載體從上述同源重組的基本原理出發(fā),分別針對同源重組的底物類型(單鏈/雙鏈、線性/環(huán)狀)、重要蛋白(RecA酶、RecBCD酶等及噬菌體中具有相似功能的酶)和功能位點(diǎn)(Chi位點(diǎn))等進(jìn)行分子設(shè)計(jì),即可開發(fā)出各種不同的基因敲除方法,如表1所示。根據(jù)同源重組載體的不同,可以把基因敲除方法分為線性單鏈DNA(ssDNA)、線性雙鏈DNA(dsDNA)以及環(huán)狀雙鏈DNA(質(zhì)粒載體)等3類。線性單鏈DNA敲除策略不但打靶載體易于構(gòu)建,且其重組效率是雙鏈DNA的10~100倍。采用線性雙鏈DNA進(jìn)行同源重組,是近年來基因敲除方法的熱點(diǎn)之一。其優(yōu)點(diǎn)是可以避免較為繁瑣的基因克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建步驟,而直接采用PCR方法擴(kuò)增獲得目標(biāo)同源重組片段。然而,線性雙鏈DNA易于被細(xì)胞內(nèi)的RecBCD酶降解,為了解決上述問題,可以在線性雙鏈DNA的兩側(cè)引入Chi位點(diǎn),保護(hù)DNA不被RecBCD消耗,并能強(qiáng)化RecBCD介導(dǎo)的同源重組效率。在應(yīng)用越來越廣泛的Red/ET重組系統(tǒng)中,Gam(γ)蛋白的引入同樣是為了抑制宿主菌的重組蛋白RecBCD的線性雙鏈DNA外切酶活性,從而協(xié)助Exo和Beta蛋白完成同源重組。RecA輔助的λRed重組則可進(jìn)一步提高重組效率。構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒載體進(jìn)行目標(biāo)基因敲除的方法,是實(shí)現(xiàn)微生物基因敲除的經(jīng)典策略,主要通過微生物本身的RecA重組系統(tǒng)(主要包括RecA和RecBCD等蛋白)發(fā)揮作用。RecA蛋白是單鏈結(jié)合蛋白,促進(jìn)各類DNA分子間的同源聯(lián)會、配對、鏈交換和分支遷移。RecBCD是由RecB、RecC和RecD三個蛋白組成的復(fù)合體,它能與雙鏈切口結(jié)合使DNA鏈解開,并在Chi位點(diǎn)形成單鏈,然后由RecA蛋白促進(jìn)同源重組。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性,所以線性DNA分子在細(xì)菌體內(nèi)會被降解。因此,必須通過環(huán)狀質(zhì)粒載體克隆來完成同源重組片段的分子設(shè)計(jì)和構(gòu)建。通常情況下,實(shí)現(xiàn)同源重組的同源臂長度都在數(shù)百bp或更長。插入型敲除可以通過同源單交換實(shí)現(xiàn),而置換型敲除則需要通過同源雙交換來實(shí)現(xiàn)。在上述過程中,為了強(qiáng)化同源重組發(fā)生的效率,良好區(qū)分單交換和雙交換型重組菌株,并使發(fā)生交換后的質(zhì)粒從宿主菌中快速去除,可以采用在質(zhì)粒載體上相應(yīng)設(shè)計(jì)兩個不同的正負(fù)篩選標(biāo)記及構(gòu)建自殺型或溫度敏感型質(zhì)粒載體等策略[16,17,18,19,20,21]。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展,除了同源重組外,位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組引起的基因插入突變也逐漸受到重視。下面就細(xì)菌、放線菌等工業(yè)微生物中應(yīng)用的3種重要的基因敲除策略進(jìn)行詳細(xì)的介紹和討論。3一些有效的基因分離策略3.1使用輔助質(zhì)粒的r-pcr和flp重組基因敲除Red重組系統(tǒng)原來是屬于λ噬菌體的重組系統(tǒng),其編碼基因exo和bet置于PL操縱子的控制之下。exo基因的產(chǎn)物Exo蛋白(也稱為Redα蛋白)是λ核酸外切酶,它可將dsDNA的5′端切開,產(chǎn)生3′突出端。bet基因編碼的β蛋白,是具有退火和鏈侵入功能的單鏈結(jié)合蛋白。當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí),帶有同源臂的供體DNA分子首先經(jīng)Exo蛋白(Redα)作用而使其兩端形成單鏈懸突;之后β蛋白形成環(huán)形結(jié)構(gòu)并結(jié)合到3′突出末端,對ssDNA進(jìn)行保護(hù),并依靠被結(jié)合的同源臂進(jìn)行配對重組。為起到這一作用,β蛋白只需要結(jié)合35bp的單鏈核苷酸即可。與傳統(tǒng)的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)相比,Redα蛋白的功能類似于RecBCD,而Redβ蛋白的功能類似于RecA。因此,Red重組系統(tǒng)可以不依賴于RecA蛋白而完成同源重組。但是,缺失RecA不僅使重組效率下降,而且載體穩(wěn)定性也會有所下降。另外,Stewart等在1998年還報(bào)道了一種通過在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)Rac噬菌體的RecE和RecT蛋白來介導(dǎo)同源重組的ET重組系統(tǒng)。其中RecE和Redα蛋白的作用相似,RecT和Redβ蛋白的作用相似,所以經(jīng)常和Red重組一起被稱為Red/ET重組系統(tǒng)。Datsenko和Wanner等以Red重組系統(tǒng)為核心開發(fā)了一套輔助質(zhì)?；蚯贸绦?以其諸多優(yōu)點(diǎn)和較為廣泛的普適性被大量運(yùn)用到基因敲除的研究中。他們運(yùn)用這套基因敲除程序在大腸桿菌中完成了40個以上不同染色體基因的敲除而未產(chǎn)生任何差錯。以β-xylosidase基因yagH的敲除為例,應(yīng)用λRed質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除的基本流程如圖2所示,其中,使用的輔助質(zhì)粒共有3個,一個是帶有兩個FRT片段及中間嵌入抗性片段的抗性片段模板質(zhì)粒pKD13;一個是可以表達(dá)Red重組酶的同源重組輔助質(zhì)粒pKD46;另外一個是帶有FLP酶表達(dá)系統(tǒng)的抗性去除輔助質(zhì)粒pCP20。其中,pKD46和pCP20輔助質(zhì)粒都是溫敏型復(fù)制子,在42℃下質(zhì)粒復(fù)制被抑制并在傳代過程中丟失。由圖2可見,使用輔助質(zhì)粒的Red重組系統(tǒng)一般包括4個主要步驟。第1步,是以pKD13為模板的基因擴(kuò)增,通過PCR引物設(shè)計(jì),引入待敲除目標(biāo)基因兩側(cè)的延伸同源序列(約50bp),獲得中間為Kan抗性基因和FRT標(biāo)記、兩側(cè)為短同源臂的線性同源重組片段。第2步是核心的同源重組,包括將攜帶Red重組酶的質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞、表達(dá)了Red重組酶的感受態(tài)細(xì)胞的制備、同源片段的電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入及同源重組發(fā)生等幾個關(guān)鍵步驟。其中,感受態(tài)細(xì)胞的制備一定要在阿拉伯糖誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46的ParaB啟動子高效表達(dá)γ、β和α蛋白之后;而質(zhì)粒pKD46的去除則采用42℃熱激偶合氨芐青霉素抗性負(fù)篩選的策略。同源重組之后,Kan抗性基因即成功插入染色體,并替代原yagH基因。第3步是成功敲除目標(biāo)基因的陽性重組子的菌落PCR篩選和驗(yàn)證。最后一步,是在陽性重組子的細(xì)胞中轉(zhuǎn)入表達(dá)FLP重組酶的輔助質(zhì)粒pCP20,FLP重組酶直接作用于抗性基因外延兩端的兩個對應(yīng)FRT區(qū)(FLP的識別目標(biāo))并再次發(fā)生同源重組,用一個FRT片段代替原有的兩個FRT片段及中間的抗性基因,從而達(dá)到去除抗性基因的目的。質(zhì)粒pCP20的去除則同樣采用42℃熱激偶合抗生素抗性負(fù)篩選的策略。這套質(zhì)粒輔助λRed重組酶基因敲除系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn):操作過程簡便,無須構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒,直接通過線性片段轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)同源重組,避免了繁瑣的酶切及連接過程;可去除抗性篩選基因,用同一套抗性輔助質(zhì)粒系統(tǒng)可進(jìn)行多基因疊加敲除;只需很短的同源片段(30~50bp)即可完成同源重組,節(jié)省了人力物力,尤其是在基因序列不很清楚的情況下,可根據(jù)有限的基因序列信息設(shè)計(jì)同源片段實(shí)施基因敲除;同源重組效率高,準(zhǔn)確度高。目前,這套系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、痢疾桿菌、鏈霉菌等多種微生物的基因敲除中。3.2同源重組雙交換使用環(huán)狀質(zhì)粒載體進(jìn)行基因敲除的首要條件是要選擇宿主細(xì)胞的自殺質(zhì)粒載體來攜帶目標(biāo)基因的同源序列。在實(shí)施目標(biāo)基因敲除過程中,只發(fā)生一次同源重組的,稱為同源單交換。該方法簡單、易行,單交換發(fā)生后整個質(zhì)粒載體插入到目標(biāo)基因內(nèi)部,同時(shí)產(chǎn)生兩個拷貝的無活性目標(biāo)基因。其示意圖如圖3A所示。在具體實(shí)施過程中,需要注意的是構(gòu)建同源重組載體時(shí),目標(biāo)基因片段要選擇中間一段,即不含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。一般情況下,單交換比較穩(wěn)定,回復(fù)突變的概率僅為10-4~10-5/代。馬玉超等利用此法成功敲除了丙烯酰胺生產(chǎn)菌株紅色紅球菌的副產(chǎn)物基因。顧名思義,同源重組雙交換就是要通過兩次單交換才能達(dá)到敲除目標(biāo)基因的目的,又分為缺失突變和插入突變兩種類型,如圖3B和圖3C所示。缺失突變是指基因敲除后使基因組上的目標(biāo)基因缺失編碼區(qū)中的某一段而達(dá)到失活目標(biāo)基因的目的;插入突變則是指基因敲除后使基因組上的目標(biāo)基因內(nèi)部插入額外一個基因而達(dá)到目標(biāo)基因失活的目的。為了便于后期篩選雙交換重組子,額外插入的基因通常為抗生素抗性基因。同源雙交換的難點(diǎn)之一是如何提高第二次同源重組的效率。針對該問題,可以采用合適的負(fù)篩選標(biāo)記,使含載體序列的細(xì)胞對某些特殊的培養(yǎng)條件敏感,從而促進(jìn)同源重組的發(fā)生和載體序列丟失,極大地提高篩選效率。SacB是Bacillussubtilis的果聚糖蔗糖酶,可轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)生果糖并合成果聚糖,在革蘭氏陰性菌中,果聚糖在細(xì)胞周質(zhì)空間大量積累,會堵塞周質(zhì)空間而使細(xì)菌致死。當(dāng)以SacB為負(fù)篩選標(biāo)記時(shí),在添加蔗糖條件下,只有發(fā)生同源重組雙交換的細(xì)胞才能夠存活。由于較為普遍的適用性和篩選方法的簡單性,許多革蘭氏陰性細(xì)菌均采用sacB基因作為負(fù)篩選標(biāo)記。另外,也有此系統(tǒng)成功應(yīng)用于革蘭氏陽性菌的報(bào)道,此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可以在不引入抗生素抗性的基礎(chǔ)上連續(xù)高效地敲除多個基因。目前,除了大腸桿菌、酵母菌等一些模式菌株的遺傳轉(zhuǎn)化效率較高、方法簡便外,其他一些菌株的遺傳背景不是很清楚,需要用電轉(zhuǎn)化儀才能將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所以,同源重組的另一個難點(diǎn)是如何用簡便的方法將質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)基因的宿主細(xì)胞。針對該難點(diǎn),研究者可以將可移動原件mob引入載體,從而使載體能夠通過簡單的細(xì)菌接合實(shí)驗(yàn)高效地導(dǎo)入細(xì)胞中。3.3轉(zhuǎn)座子基因敲除基因轉(zhuǎn)座子(Transposon,Tn)是一種DNA序列單元。它能夠隨機(jī)插入到細(xì)菌染色體的許多位點(diǎn)上,使得插入位置的基因失活或突變。轉(zhuǎn)座子能夠啟動不同類型的重組事件發(fā)生,還可從插入位點(diǎn)脫落下來。在脫落時(shí),可攜帶宿主基因組的一部分DNA片段,造成基因缺失。利用該特性,轉(zhuǎn)座子被廣泛應(yīng)用于基因敲除研究中,成為改良菌種的新技術(shù)。典型的轉(zhuǎn)座子其兩端多為兩個顛倒重復(fù)序列(IS序列),在重復(fù)序列之間有編碼抗生素的基因及轉(zhuǎn)座酶。常見的轉(zhuǎn)座子有Tn5、Tn10、Tn916等。其中,Tn916具備廣泛的寄主范圍,可以應(yīng)用于多種革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。轉(zhuǎn)座子插入后穩(wěn)定性好,不容易發(fā)生回復(fù)突變。采用基因轉(zhuǎn)座子對目標(biāo)基因組進(jìn)行隨機(jī)敲除,構(gòu)建基因敲除突變庫,然后對目標(biāo)突變庫進(jìn)行高通量篩選,獲得所需要的表型,是近來反向代謝工程的研究熱點(diǎn)之一,其示意圖如圖4所示。對于敲除基因的篩選與鑒定,Badarinarayana在2001年報(bào)道了一種應(yīng)用轉(zhuǎn)座子和自殺質(zhì)粒進(jìn)行基因插入敲除的新方法。HalAlper等利用類似的方法,成功篩選并鑒定了在重組大腸桿菌中高產(chǎn)番茄紅素所必須敲除的3個負(fù)調(diào)控基因;將這3個基因與理論預(yù)測的4個基因偶合起來進(jìn)行不同組合突變,獲得了64株敲除不同基因的突變株。全局最優(yōu)突變株的番茄紅素的產(chǎn)率較原始菌株提高了9倍。然而,由于轉(zhuǎn)座子自身編碼轉(zhuǎn)座酶,從而遺傳穩(wěn)定性存在問題;轉(zhuǎn)座子片段過大,插入后對受體菌株帶來負(fù)擔(dān),以及需要構(gòu)建自殺質(zhì)粒作為載體等問題,近年來進(jìn)一步發(fā)展了EZ-Tn5TMInsertionKits轉(zhuǎn)座敲除系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^體外反應(yīng),使得Tn5轉(zhuǎn)座酶與線性DNA形成聯(lián)合復(fù)合體,繼而電轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞,進(jìn)行高效的基因隨機(jī)插入敲除。線性DNA聯(lián)合復(fù)合體的中間部分是抗生素抗性基因,兩端各含有19bp的反向重復(fù)序列(ME),是Tn5轉(zhuǎn)座酶的結(jié)合位點(diǎn)。研究表明,上述轉(zhuǎn)座體系在多種革蘭氏陰性或陽性細(xì)菌中均適用。采用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)方法或EZ-Tn5?InsertionKits中專門設(shè)計(jì)的測序定位引物,還可特異性地?cái)U(kuò)增轉(zhuǎn)座子IS序列的側(cè)翼被敲除基因,從而鑒別或發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)表型特征相關(guān)的功能基因,并構(gòu)建或重構(gòu)基因敲除前后各表型相關(guān)的代謝途徑。根據(jù)這些新的基因型和代謝途徑信息,反過來又可進(jìn)一步提出理性設(shè)計(jì)策略,構(gòu)建性能更加優(yōu)越的重組菌株。轉(zhuǎn)座子基因敲除系統(tǒng)的缺陷是,基因插入過程基本上是隨機(jī)的,一般不能用于某一特定基因的敲除,也很難在基因組范圍內(nèi)突變所有的基因。因此,通常將轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)與直接突變的方法進(jìn)行互補(bǔ)。4在真核生物細(xì)胞中的應(yīng)用綜上所述,根據(jù)重組位點(diǎn)特征的不同,基因敲除技術(shù)可以分為依賴于較長同源序列的同源重組、依賴于短同源序列的位點(diǎn)特異性重組以及不依賴于同源序列的轉(zhuǎn)座敲除等3種主要類型。其中,位點(diǎn)特異性重組主要在酵母菌等真核生物中應(yīng)用。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)理論的發(fā)展,新的基因敲除原理也在不斷的發(fā)掘和發(fā)現(xiàn)。最具代表性的就是RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)。RNAi是指通過利用短片段的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來高效、特異地阻斷特定基因的表達(dá),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因沉默的表型。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá),并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中,所以RNAi的反應(yīng)過程也可以用于基因敲除。到目前為止,RNAi技術(shù)作為基因沉默的工具,被研究人員廣泛應(yīng)用到真核生物細(xì)胞的功能基因組學(xué)、藥物靶點(diǎn)篩選、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路分析、疾病治療等研究領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有投入少、周期短、操作簡單等優(yōu)勢,具有良好的發(fā)展前景。總結(jié)了細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等幾種重要工業(yè)微生物中已經(jīng)成功應(yīng)用的基因敲除策略,見表2。然而,盡管基因敲除技術(shù)的原理在發(fā)展,應(yīng)用越來越廣泛,但基因敲除技