基因工程菌細胞的研究進展

基因工程菌細胞的研究進展

狹義調理是一項遺傳因子技術，其基本過程主要包括以下五個方面：1）從供細胞中分離dna，用有限核酸內切酶（包括外源基因和目標基因）和載體分子切開（省略）。2）用dna連接酶將含有外源基因的dna段連接到載體分子中，形成dna重組分子（簡稱直接程序）。3）通過細胞轉化手段將dna重組分子引入受體（簡稱轉移）。4）以短期培養(yǎng)轉化細胞，并相應地增加、釋放dna重組分子，或將其合并到受細胞的矩陣中（簡稱添加）。5）選擇并評估轉化細胞，以獲得能夠有效穩(wěn)定表達外源基因的基因（簡稱檢測）。作為現(xiàn)代生物工程的關鍵技術,基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達,基因工程菌(細胞)即是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應器。用于重組DNA技術中的宿主細胞既有原核生物,又有真核生物,典型的宿主細胞如:大腸桿菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母等。在重組基因工程菌培養(yǎng)過程中,遇到的主要問題有:l)有機酸類代謝副產(chǎn)物積累并抑制菌體生長和產(chǎn)物的表達;2)大規(guī)模及高密度培養(yǎng)過程的供氧限制;3)外源基因高表達引起宿主細胞生理負擔過重;4)質粒不穩(wěn)定性問題。其中,質粒的穩(wěn)定性研究尤為重要,對于一定結構的基因工程菌而言,提高質粒的穩(wěn)定性對于基因產(chǎn)物的生產(chǎn)及科學研究具有重要意義,就基因工程菌中影響質粒穩(wěn)定性的因素及提高穩(wěn)定性的策略展開綜述。1質粒的分離不穩(wěn)定性重組質粒的不穩(wěn)定性,是指重組菌在培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或丟失,結果使重組菌失去了原有的表型特征。依據(jù)重組質粒的變化本質,質粒不穩(wěn)定性可分為結構不穩(wěn)定性、分離不穩(wěn)定性。質粒的結構不穩(wěn)定主要是由于DNA的插入、缺失或重排等引起的不穩(wěn)定,使目的基因功能丟失,但對質粒主要遺傳標記丟失影響較小。質粒的分離不穩(wěn)定是細胞在分裂后分離時引起的不穩(wěn)定,由于質粒在子代細胞中的不均勻分配而使部分細胞不含質粒,是質粒丟失的主要原因。質粒的分離不穩(wěn)定性常出現(xiàn)在兩種情況,一是傳代質粒只在許多世代之后才明顯產(chǎn)生丟失;二是帶有質粒的細胞與無質粒細胞有不同的生長速率導致。外源基因載體DNA的存在猶如細胞內存在多拷貝的質粒一樣,對宿主是一種代謝負擔,當外源基因大量產(chǎn)生特異蛋白時,這種代謝壓力就變得更加嚴重。一般條件下,帶有重組質粒的宿主菌的生長速率低于無質粒的細菌,由此,質粒的穩(wěn)定性伴隨著生長速率的不同而變化?；蛑亟M菌的比生長速率對質粒穩(wěn)定性有很大的影響,在連續(xù)培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)在低比生長速率(0.302h-1)下重組質粒只可以完全維持20代。O’Kennedy等(1995)發(fā)現(xiàn),在復合培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基中,重組釀酒酵母的質粒穩(wěn)定性和比生長速率的關系不同。在葡萄糖限制的復合培養(yǎng)基中,質粒丟失速率隨稀釋率的增加而增大,但是在葡萄糖限制的基本培養(yǎng)基中則相反。2影響因子的谷物不穩(wěn)定性2.1枯草桿菌和酵母的穩(wěn)定性重組質粒的穩(wěn)定性在很大程度上受宿主細胞遺傳特性的影響。相對而言,重組質粒在大腸桿菌中比較穩(wěn)定,在枯草桿菌和酵母中較不穩(wěn)定,但是也有例外。黃立志等發(fā)現(xiàn)外源NK基因的導入對宿主E.coliHB101與yeastPichiaGS115DE生長沒有明顯影響,重組質粒Pbv220-NK在大腸桿菌中結構穩(wěn)定性有待提高,而在畢赤酵母中穩(wěn)定性很好。2.2質粒載體的選擇在重組菌細胞中,質粒載體的大小與拷貝數(shù)是影響質粒分離不穩(wěn)定的重要因素。插入DNA片段的大小及特性等在質粒分離不穩(wěn)定性中有關系,一般小的片段質粒比較穩(wěn)定。對于松弛型質粒載體,一般情況下,伴隨著細胞分裂,質粒以隨機方式分配到子粒細胞中,質?？截悢?shù)越高,出現(xiàn)無質粒載體細胞的概率就越低,質粒就越穩(wěn)定,而質粒載體的寡聚化效應會導致質粒載體拷貝數(shù)大大降低,從而加重質粒的分離不穩(wěn)定性。MichelleE.Gahan等研究發(fā)現(xiàn)口腔減毒疫苗菌株BRD質?？截悢?shù)降低影響質粒穩(wěn)定性及人類特異性免疫反應的降低。2.3影響質粒穩(wěn)定性因素的因素外源基因的調控突變、培養(yǎng)條件及質粒中所攜帶的外源基因性質、重組菌的生長速率、外源基因的表達水平等因素都是影響質粒穩(wěn)定性的因素,有些需要在質粒設計和構建時仔細考慮,有些則與培養(yǎng)過程有關。3提高優(yōu)質粒穩(wěn)定性的策略3.1質粒質量變異規(guī)律為了構建穩(wěn)定的結構體,最好利用小的質粒,小的質粒在高密度發(fā)酵中遺傳性狀比較穩(wěn)定,而大的質粒往往由于發(fā)酵環(huán)境中各種因素的影響,而出現(xiàn)變異的幾率較高。Kim等報道,用穿梭質?？寺〈竽c桿菌DNA片斷,轉化大腸桿菌,重組質粒能穩(wěn)定地傳代;而轉化Pseudomonasputida后,重組質粒在傳代過程中發(fā)生分離。3.2對重組質粒的影響B(tài)ion和Luxen報道,插入DNA片斷的大小,在質粒分離不穩(wěn)定性中有關系。他們酶切同源和外源染色體DNA,得到大小不同的片斷,與穿梭質粒pwB110重組。得到兩個重組質粒pLB2(3.6kb)和pLB5(5.9kb),轉入枯草桿菌后,重組質粒的穩(wěn)定性表現(xiàn)出和插入DNA片斷大小有關。而轉入大腸桿菌,重組質粒卻不表現(xiàn)出這種相關性。趙月娥等對人tPA基因進了重建,保留了F、G和P區(qū)并引入突變,構建了K1,K2區(qū)缺失突變的重組tPA質粒pQE30,并在大腸桿菌JM109菌株中成功表達。從理論上分析與實驗數(shù)據(jù)均顯示,由于重建的tPAr基因的DNA長度減少了40%,克隆并導入宿主菌后,具有更高的遺傳穩(wěn)定性。parDE基因的插入,可提高重組質粒穩(wěn)定性。莫志偉等將parDE基因插入到pST1021等質粒上可以提高重組質粒的遺傳穩(wěn)定性,提高基因工程菌的應用效果。趙立平等也利用RK2質粒的parDE片段提高重組質粒在生防菌成團泛菌中的穩(wěn)定性。3.3枯草桿菌和酵母菌株的穩(wěn)定性重組質粒的穩(wěn)定性在很大程度上受宿主細胞遺傳特性的影響。相對而言,重組質粒在大腸桿菌中比較穩(wěn)定,在枯草桿菌和酵母中較不穩(wěn)定,但是也有例外。同一宿主菌株對不同質粒的穩(wěn)定性不同,而同一質粒在不同宿主菌株中的穩(wěn)定性也有差別。因此對于不同的表達系統(tǒng)、外源基因表達產(chǎn)物的性質、表達產(chǎn)物是否需要進行后加工及其復雜程度將決定宿主菌的選擇,如真核或原核生物、蛋白酶缺陷型或營養(yǎng)缺陷型等的宿主菌。3.4質粒體誘導表達重組菌的穩(wěn)定性受遺傳及環(huán)境因素兩方面的控制,所以可以通過基因水平的控制來限制反應器中無質粒細胞的繁殖以提高系統(tǒng)中含質粒細胞的比例。在重組菌培養(yǎng)過程中通常采用增加“選擇壓力”來提高重組菌的穩(wěn)定性?！斑x擇壓力”通常包括:1)在質粒構建時,加入抗生素抗性基因,在生物反應器的培養(yǎng)基中加入抗生素以抑制無質粒細胞(P-)的生長和繁殖;2)利用營養(yǎng)缺陷型細胞作為宿主細胞,構建營養(yǎng)缺陷型互補質粒,設計營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基抑制無質粒細胞(P-)的生長和繁殖;3)噬菌體抑制及轉化子中自殺蛋白的表達,在含“選擇壓”的培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌可以有效地抑制(P-)細胞的生長和繁殖,提高質粒穩(wěn)定性。這種方法對于質?；蛩拗骷毎旧戆l(fā)生了突變,雖保留了選擇性標記、但不能表達目的產(chǎn)物的細胞無效。史悅等發(fā)現(xiàn)質粒PETNHM在無抗生素選擇壓力下,連續(xù)傳代48代后質粒丟失的無質粒細胞開始出現(xiàn),進一步研究表明,卡拉霉素的選擇壓力能夠保證質粒的穩(wěn)定遺傳。3.5控制培訓條件3.5.1質粒穩(wěn)定性分析培養(yǎng)基組成成分及其比例對質粒的穩(wěn)定性影響較大,Jones和Melling研究了連續(xù)培養(yǎng)中E.coli中幾種質粒的穩(wěn)定性,分別以葡萄糖、磷酸鹽和無機鹽作為限制性基質,發(fā)現(xiàn)除pBR325外的大部分質粒在以磷酸鹽為限制性基質時很快丟失。周宇荀等也發(fā)現(xiàn)抗菌肽基因Adenoregulin(ADR)培養(yǎng)基中適當加入葡萄糖,對質粒的穩(wěn)定性及蛋白表達量有重要作用。3.5.2固定化膠粒內細胞的穩(wěn)定性對固定化重組工程菌菌培養(yǎng)來說,氧傳遞受固定化膠粒屏障和膠粒表面高濃度細胞的限制,攪拌速率影響著培養(yǎng)液內的氧供應和對菌體的剪切力,強烈攪拌使固定化膠粒內細胞濃度明顯減少,質粒穩(wěn)定性也顯著降低,溫和的攪拌速率適于保存質粒的穩(wěn)定性。在攪拌罐發(fā)酵時,質?？截悢?shù)通常比搖瓶培養(yǎng)低,原因是攪拌罐中有較好通氣,生長速率較高,染色體復制增加,當溶解氧強度在非選擇性培養(yǎng)基中周期變化時,重組酵母連續(xù)培養(yǎng)質粒穩(wěn)定性強烈依賴于培養(yǎng)的生長速率,在較低生長速率下完全穩(wěn)定,提高氧壓力或增加氧濃度能引起細胞內氧化性脅迫,而過渡或穩(wěn)定階段缺氧條件引起氨基酸生產(chǎn)和質粒穩(wěn)定性受限制。3.5.3質粒穩(wěn)定性和外源基因表達有的質粒屬溫度敏感型質粒,如農桿菌質粒,當農桿菌培養(yǎng)溫度超過30℃,即引起質粒丟失;KwangH.Son等也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度處于30℃~44℃時,巨大芽孢桿菌PCK108質粒結構基本穩(wěn)定,而且其目的產(chǎn)物———纖維素酶產(chǎn)量比30℃時顯著提高,但30℃時質粒穩(wěn)定性較強。對于溫度敏感型質粒,為了控制在生長前期其外源基因不表達,一般采用二階段溫度培養(yǎng)系統(tǒng),即在菌體生長階段,采用較低的培養(yǎng)溫度,當菌體生長至適宜濃度和生長時期時,提高溫度進行誘導,使外源基因表達。與一般微生物發(fā)酵相似,重組工程菌的生長和產(chǎn)物合成時的pH值往往不同,如重組Lactococcuslactissubsp.Lactis(pIL252)對生長和質粒穩(wěn)定性的最適pH值分別為6.39和6.41。3.5.4選擇合適的培訓方法3.5.4.性時糖酸鈉的質粒穩(wěn)定性不同流加方式對質粒的穩(wěn)定性影響也較大。在研究生產(chǎn)重組葡聚糖酶的枯草桿菌質粒穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn),周期性分批流加的酶產(chǎn)量和質粒穩(wěn)定性高于間歇培養(yǎng)和恒化器培養(yǎng),周期2~4h,質粒穩(wěn)定;大于6h,質粒丟失增多,而間歇性培養(yǎng)和恒化器培養(yǎng)時質粒很快丟失。另外,選擇合適的流加方式可提高質粒在非選擇性培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性和工程菌的產(chǎn)量。3.5.4.發(fā)酵產(chǎn)物合成連續(xù)培養(yǎng)的方式很多,一種選擇性循環(huán)反應器在連續(xù)培養(yǎng)過程中采用誘導方法使含質粒細胞在分離器中絮凝,而細胞生長和產(chǎn)物合成在主發(fā)酵罐中進行,循環(huán)過程將目的菌株(含質粒菌株)和非目的菌株(不含質粒或雜菌)分開,富集重組菌或生產(chǎn)菌,能使含質粒細胞占優(yōu)勢并能高速合成外源蛋白。連續(xù)培養(yǎng)的稀釋速率對質粒穩(wěn)定性有顯著影響。對含重組質粒PLG669-2的釀酒酵母研究發(fā)現(xiàn),稀釋速率周期變化時,周期的振幅和頻率是質粒穩(wěn)定性的重要參數(shù)。3.5.4.固定化細胞反應器細胞固定化是在固定化酶技術的基礎上發(fā)展起來的,細胞的固定化方法可以分為吸附法、包埋法、交聯(lián)法及共價法等。由于大部分細胞在固定化后仍可以保持生長繁殖能力,因此,大多數(shù)研究工作都集中在吸附法和包埋法。固定化細胞的主要優(yōu)點是:細胞可以重復或連續(xù)使用,可以提高生產(chǎn)效率;另外,細胞固定化后,可以為細胞創(chuàng)造一個適宜的局部環(huán)境(如溫度、pH、剪切力等),有利于細胞的生長和產(chǎn)物表達。對于基因工程菌而言,相對于游離細胞懸浮培養(yǎng),固定化細胞培養(yǎng)可以有效克服或減少質粒不穩(wěn)定現(xiàn)象,特別用非選擇性培養(yǎng)基時,固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可提高反應器產(chǎn)率,得到高細胞濃度和高產(chǎn)物。在固定化細胞培養(yǎng)體系中,重組質粒穩(wěn)定性得到提高,但其機理還不是很清楚,主要原因可能有:l)固定化細胞的生長速率下降;2)細胞的區(qū)域化分布;3)固定化材料的物理結構和化學性質影響質粒穩(wěn)定性,使得質粒的分離不穩(wěn)定性得到改善,不含質粒細胞的生長優(yōu)勢減少,使質粒穩(wěn)定性高于游離細胞培養(yǎng)。在細胞固定化方法及固定化細胞反應器的研究中,應該注意盡可能地應用最簡單的固定化方法及與其相匹配的最優(yōu)生物反應器。中空纖維反應器、固定床反應器、三相流化床反應器等就是其中的典型例子,這些反應器有些己經(jīng)工業(yè)化