第四章 目的基因的制備1

主講教師:任國領(lǐng)生命科學(xué)學(xué)院第四章

目的基因的制備為使優(yōu)良性狀聚集于同一生物體，在生物群體中分離其編碼蛋白（酶）的結(jié)構(gòu)基因，創(chuàng)造出有價值的新物種。生物界的長期進化積累了大量對人類有用的基因，這是一個寶貴的資源。準(zhǔn)備要分離、改造、擴增、表達(dá)的基因。一、目的基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)、核糖體識別區(qū)、編碼區(qū)(起譯碼ATG、ORF、休止碼TAG或TAA或TGA)、終止轉(zhuǎn)錄區(qū)1、結(jié)構(gòu)基因的組成一、目的基因基因區(qū)：操縱子;基因之間有間隔序列。啟動區(qū)：RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的片段SD區(qū)：起譯碼ATG上游約10bp處的富含嘌呤的保守區(qū)，其轉(zhuǎn)錄物：5’AGGAGGU3’，核糖體16SrRNA識別、結(jié)合mRNA的位置。（1）原核生物基因的組成一、目的基因轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子分別指基因或操縱子3’端提供轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列；協(xié)助mRNA聚合酶識別終止信號的輔助蛋白。原核的終止子在終止點之前有一回文結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)發(fā)夾。一、目的基因基因區(qū)：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)：r、m、tRNA分別由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ轉(zhuǎn)錄。編碼蛋白的啟動子(RNA聚合酶Ⅱ識別)可尋找三個保守區(qū)：

-20~-30的TATAA/TA區(qū)(Hogness框)——起始解鏈，決定起錄點。

-75的9bp共有序列GGT/CCAATCT區(qū)(CAAT框)與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān)

-75區(qū)上游有一共有序列GGGCGC(GC框)——結(jié)合某些轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄終止區(qū):（2）真核生物基因的組成一、目的基因2、基因的排列一般：直線排列于DNA上，且兩基因之間有非編碼序列。特例：（1）重疊基因（2）重復(fù)基因（3）加倍基因（4）基因重排約30%真核基因是多拷貝較高等的生物基因組是二倍體或多倍體質(zhì)粒在宿主內(nèi)是多拷貝基因組中同一基因簇處于不同細(xì)胞而發(fā)生基因排列變化一、目的基因二、目的基因的制備1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法二、目的基因的制備1.直接分離法（1）限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片段。二、目的基因的制備應(yīng)用對象適用于從簡單的基因組中分離目的基因，如質(zhì)?；虿《敬笮≈挥袔浊A基，大的也不超過幾十萬堿基，編碼基因比較少，獲得也比較簡單。已定位：根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的酶切位點，一次就可以獲得。已定序：只需要用已知序列的限制性內(nèi)切酶進行一次或者多次酶切，分離純化所需的DNA片段，與適當(dāng)載體連接。未定序或無定位：也只需酶切分析，隨后再通過部分酶切，構(gòu)建一個簡單的基因文庫，然后釣出目的基因。二、目的基因的制備優(yōu)點由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。缺點目的基因易被切碎。二、目的基因的制備（2）隨機片段法①限制性內(nèi)切酶局部消化法控制酶的用量和時間，使基因組的酶切位點只有一部分被隨機切開。選用原則：a.內(nèi)切酶識別位點和堿基數(shù)b.內(nèi)切酶粘性末端二、目的基因的制備②機械切割法a.超聲波b.高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0min，產(chǎn)生約8kb的隨機片段。二、目的基因的制備（3）物理化學(xué)法基本原理：AT和GC之間氫鍵的差異，導(dǎo)致不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)如浮力密度和解鏈溫度等也明顯不同，采用相應(yīng)的方法即到達(dá)分離的目的。二、目的基因的制備1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法二、目的基因的制備2、構(gòu)建基因組文庫分離法用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個受體菌的群體，即構(gòu)成了這種生物的基因組文庫。若只儲存某生物基因組的部分遺傳信息，即構(gòu)成部分基因組文庫。（1）基因組文庫的定義將某種生物的基因組DNA切割成大小合適的片段，并將這些所有片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的受體細(xì)胞中進行保存和擴增。理論上將，這些重組載體帶有該生物的全部基因。稱基因文庫（GeneLibrary）二、目的基因的制備N=ln(1-P)/ln(1-f)N：文庫必需的克隆數(shù)P：文庫中目的DNA片段的出現(xiàn)概率f：插入片段大小/全基因組大小的比值（2）基因組文庫的大小二、目的基因的制備（3）基因組文庫的構(gòu)建對載體的要求載體能容載的DNA片段大小直接影響到構(gòu)建完整的基因組文庫所需的重組子的數(shù)目。載體的容量越大，需要的重組子越少。目前常用的載體二、目的基因的制備載體與片段的連接方式直接連接、人工接頭或同聚物加尾。①粘性末端直接連接②人工接頭法人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片段。二、目的基因的制備③同聚物加尾二、目的基因的制備獲得含基因的DNA片段與λ噬菌體克隆載體重組轉(zhuǎn)化受體菌并篩選重組子（見導(dǎo)入受體細(xì)胞第五章）①構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫的步驟常見的基因組文庫的構(gòu)建二、目的基因的制備目的基因準(zhǔn)備要分離、改造、擴增、表達(dá)的基因。1.什么叫目的基因？由哪些部件組成？原核和真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成有何區(qū)別？轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)、核糖體識別區(qū)、編碼區(qū)(起譯碼ATG、ORF、休止碼TAG或TAA或TGA)、終止轉(zhuǎn)錄區(qū)知識回顧基因區(qū)：操縱子;基因之間有間隔序列。啟動區(qū)：RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的片段SD區(qū)：起譯碼ATG上游約10bp處的富含嘌呤的保守區(qū)，其轉(zhuǎn)錄物：5’AGGAGGU3’，核糖體16SrRNA識別、結(jié)合mRNA的位置。（1）原核生物基因的組成轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子基因或操縱子3’端提供轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列；協(xié)助mRNA聚合酶識別終止信號的輔助蛋白。原核的終止子在終止點之前有一回文結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)發(fā)夾。知識回顧基因區(qū)：ATG+extrons+introns+TAA（TGA或TAG）轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)：編碼蛋白的啟動子(RNA聚合酶Ⅱ識別)可尋找三個保守區(qū)

-20~-30的TATAA/TA區(qū)(Hogness框)——起始解鏈，決定起錄點。

-75的9bp共有序列GGT/CCAATCT區(qū)(CAAT框)與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān)

-75區(qū)上游有一共有序列GGGCGC(GC框)——結(jié)合某些轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄終止區(qū):

mRNA3'PolyA位點“AAUAAA”為鏈的切斷和多聚腺苷化提供信號。（2）真核生物基因的組成知識回顧2.基因排列有哪些特例？特例：（1）重疊基因（2）重復(fù)基因（3）加倍基因（4）基因重排約30%真核基因是多拷貝較高等的生物基因組是二倍體或多倍體質(zhì)粒在宿主內(nèi)是多拷貝基因組中同一基因簇處于不同細(xì)胞而發(fā)生基因排列變化不同基因共用一段DNA序列。知識回顧基因組文庫的構(gòu)建過程:酶解制備外源DNA;酶切載體;連接重組并包裝進噬菌體;重組體轉(zhuǎn)染宿主菌。

優(yōu):比λ噬菌體容納的外源DNA大(30～45kb),構(gòu)建完整文庫所需克隆數(shù)少;載體僅約5kb,可直接分析插入片段的限制性圖譜,而λ噬菌體則否。缺點

:難篩選;重組效率低(105～6～104～5clongs/μgDNA);不易儲存。

3、圖示說明考斯質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建，指出與λ噬菌體載體的區(qū)別。有何優(yōu)缺點？知識回顧1)外源DNA片段的分離和制備上稍微差異；2）載體的處理比較簡單。3重組時，質(zhì)粒DNA的量要比插入片段的量高10倍，以便插入片段最大量的連接。4）需要預(yù)培養(yǎng)一段時間再轉(zhuǎn)染，得到的不是噬菌斑而是菌落。知識回顧2、cDNA基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離（1）cDNA文庫的概念cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄出的DNA。cDNA基因(部分)文庫某生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部或部分mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段，分別與載體重組而存在于一種受體的群體。二、目的基因的制備1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法二、目的基因的制備3、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴增目的基因3.1直接從基因組中擴增適合原核生物。？二、目的基因的制備3.2從mRNA中擴增：RT－PCR適合真核生物。？3.3其他類型的PCR（見第二章）二、目的基因的制備1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法二、目的基因的制備4、基因的化學(xué)合成150～200bp以內(nèi)可化學(xué)合成.要獲得較大的高等真核基因必須設(shè)計一種特殊方法,能把合成的DNA片段構(gòu)建成完整的基因的過程.稱為基因組裝.1979年首次化學(xué)合成有活性的大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸基因.現(xiàn)用DNA合成儀快速合成寡核苷酸片段,再用酶化學(xué)法獲得目的基因DNA片段.（1）基因化學(xué)合成的概況（2）基因的組裝方式二、目的基因的制備20世紀(jì)70年代提出,常用的有兩種:全片段酶促連接法:

酶促填充法:（3）化學(xué)合成方法的相關(guān)知識見第二章二、目的基因的制備（1）cDNA文庫的特點4、cDNA基因文庫有何優(yōu)點？如何構(gòu)建？知識回顧分離細(xì)胞總RNA,純化分離mRNA。以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈雙鏈cDNA的合成將合成的雙鏈DNA重組入載體，導(dǎo)入宿主(大腸桿菌)增殖（2）cDNA文庫的構(gòu)建知識回顧2、cDNA基因文庫的構(gòu)建及目的基因的分離分離細(xì)胞總RNA以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈雙鏈cDNA的合成常用方法:第一第二第三第四、五將合成的雙鏈DNA重組入載體，導(dǎo)入宿主(大腸桿菌)增殖（2）cDNA文庫的構(gòu)建目的基因篩選的策略

?1、核酸雜交篩選?2、抗體篩選?3、功能結(jié)合法篩選1、核酸雜交篩選（1）原理

將基因文庫的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜之后，進行裂解，釋放DNA并且固定在膜上，利用特異的核酸探針進行篩選，根據(jù)堿基配對原則篩選到目的基因。（2）如何獲得核苷酸探針？1）“基因園”：同源基因篩選

2）寡核苷酸簡并引物探針：對目的基因的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列有所了解，則可以從這些氨基酸序列倒過來推導(dǎo)出核酸的可能序列，合成寡核苷酸作為探針。2、抗體篩選

（1）適用范圍：已有目的基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性抗體，利用抗體篩選表達(dá)特異抗原的克隆。

（2）原理：將cDNA定向克隆到表達(dá)載體構(gòu)建成表達(dá)文庫，用能與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異結(jié)合的抗體與文庫中能表達(dá)目的基因的克隆結(jié)合，再用標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，指示目的基因所在克隆。3、功能結(jié)合法篩選

適用范圍：已知目的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能（1）噬菌體顯示法（phagedisplay）（2）酵母單、雙雜交法1985年，美國Missouri大學(xué)的SmithGP首次證實絲狀噬菌體fd基因組能通過基因工程手段改造，他把EcoRⅠ內(nèi)切酶的部分基因片段與絲狀噬菌體的次要衣殼蛋白pⅢ(proteinⅢ)基因融合，獲得的重組噬菌體能被抗EcoRⅠ內(nèi)切酶的抗體所識別，由此建立了噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnology)。噬菌體展示技術(shù)能將表達(dá)的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體的表面，進而通過親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，為篩選到目的蛋白或多肽奠定了基礎(chǔ)。（1）噬菌體顯示法（phagedisplay）噬菌體展示技術(shù)的原理

噬菌體展示技術(shù)是將外源DNA通過基因工程技術(shù)克隆到適當(dāng)?shù)氖删w載體上，使外源DNA片段對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。然后利用靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒ㄏ慈シ翘禺惤Y(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA序列測序出來。酵母雙雜合系統(tǒng)真核生物的位點特異轉(zhuǎn)錄激活因子：BDAD圖（2）酵母單、雙雜交法PGBT9又叫DNA-BD質(zhì)粒載體，其GAL4結(jié)構(gòu)域編碼序列GAL4BD克隆在乙醇脫氫酶基因啟動子PADH1下游，在GAL4BD和乙醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄終止子TADH1之間存在多克隆位點（MCS），允許誘餌蛋白編碼序列的插入。誘餌蛋白基因是按照正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)被克隆在這個載體的多克隆位點上，于是就在誘餌蛋白和GAL4-BD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白I;酵母質(zhì)粒有PGBT9和PGAD424。PGAD424又叫AD質(zhì)粒載體，用來構(gòu)件欲篩選靶蛋白的cDNA文庫的專用載體，其GAL4激活域序列GAL4AD克隆在乙醇脫氫酶基因啟動子PADH1下游，在GAL4AD和乙醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄終止子TADH1之間存在多克隆位點，允許靶蛋白cDNA的插入?？寺〉腸DNA片段按照正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入在載體的多克隆位點區(qū)內(nèi)，因此cDNA編碼的蛋白質(zhì)便會同GAL4-AD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白Ⅱ。。這兩種雜種蛋白質(zhì)都能在酵母細(xì)胞中得到高水平的表達(dá)。而且在核定位序列的作用下進入到酵母的細(xì)胞核內(nèi)。（一）篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)1、差別雜交定義：分別制備兩種細(xì)胞群體的mRNA提取物，其中一個群體含有目的基因mRNA，另一個群體不含。以這兩種總mRNA（或其cDNA)為探針，分別篩選由表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建的cDNA文庫。原理圖缺點：靈敏度低，不適于分離低豐度mRNA的目的基因；需篩選大量雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，十分費時耗力；差別雜交重復(fù)性差。三、目的基因的分離2、減法雜交技術(shù)定義：通過DNA復(fù)性動力學(xué)富集目的基因序列，并構(gòu)建減數(shù)文庫來克隆目的基因。其本質(zhì)是盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列。（1）mRNA減法雜交從表達(dá)目的基因的組織提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再與無目的基因表達(dá)的組織提取的mRNA做過量雜交，兩者均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA仍單鏈，將其分離即為差異表達(dá)序列。（二）利用差示分析法分離目的基因克隆1、mRNA差別顯示技術(shù)（差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR）