第五章 動物細(xì)胞制藥

生物技術(shù)制藥王麗萍生命科學(xué)學(xué)院第五章

動物細(xì)胞制藥第一節(jié)概述細(xì)胞學(xué)說的建立組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程學(xué)第二節(jié)動物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)一、動物細(xì)胞的形態(tài)

適應(yīng)功能,形態(tài)各異—細(xì)胞的分化（特化）離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類：貼壁依賴型細(xì)胞貼壁非依賴型細(xì)胞⒈貼壁細(xì)胞

生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型—梭型或不規(guī)則三角形上皮細(xì)胞型—扁平的不規(guī)則多角形⒉懸浮細(xì)胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細(xì)胞。⒊兼性貼壁細(xì)胞生長不嚴(yán)格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。二、動物細(xì)胞的化學(xué)組成與代謝蛋白質(zhì)：生命活動的基礎(chǔ)核酸：遺傳與代謝脂質(zhì)：維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、透膜運(yùn)輸、能量儲存糖類：主要能源、結(jié)構(gòu)組成水無機(jī)鹽有機(jī)成分三、動物細(xì)胞的生理特點(diǎn)⒈細(xì)胞的分裂周期長細(xì)胞分裂時間為12～48h，細(xì)胞的分裂周期=間期+分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）G1期：凡細(xì)胞無增殖活動時皆滯留在G1期S

期：DNA的合成，一般為6~8小時G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色體螺旋化，持續(xù)時間短，一般為2~5h。M期：一般持續(xù)時間很短，僅0.5~1h。相當(dāng)于有絲分裂的中后期和末期，主要是染色體的變化、分裂，并形成子細(xì)胞。細(xì)胞分裂代數(shù)與培養(yǎng)中的代數(shù)及相互關(guān)系。⒉細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì),并有接觸抑制現(xiàn)象。⒊正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的。原代培養(yǎng)有限細(xì)胞系無限細(xì)胞系⒋動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感。對理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。⒌動物細(xì)胞對培養(yǎng)基要求高。12種必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長因子、貼壁因子等。⒍動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位：游離核糖體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體

游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。動物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn):培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn):分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。第三節(jié)生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得

一、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求

原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系工程細(xì)胞系（融合或重組）二、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的獲得⒈原代細(xì)胞是直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。特點(diǎn)：生長分裂不旺盛需要大量動物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。應(yīng)用：藥物檢測實(shí)驗(yàn)、藥理研究生產(chǎn)藥品：雞胚細(xì)胞、原代兔或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。⒉二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。生產(chǎn)藥品：WI－38、MRC－5、2BS

⒊轉(zhuǎn)化細(xì)胞系

通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的、人工的或從腫瘤組織中建立

4.工程細(xì)胞系采用基因工程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行了修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨(dú)特性狀的細(xì)胞系。方法：正常細(xì)胞異倍體化；融合或重組。三、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性1、人源細(xì)胞株系

W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，貼壁生長能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶為G6PDB型。倍增時間為24h，有限壽命50代。安全，第一個被用于制備疫苗。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。屬成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)基用加小牛血清。同工酶G6PDB型。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。Namalwa：從肯尼亞淋巴瘤病人（Homosapiens，human)中分離獲得的類淋巴母細(xì)胞，含有部分Epstein-Barr病毒基因，但不表達(dá)完整的EB病毒。

懸浮生長，非整體核型，2n=12～14，單X染色體，無Y染色體。培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。外源基因的表達(dá)水平較高，可用無血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)。已成功地表達(dá)了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大規(guī)模生產(chǎn)干擾素，并批準(zhǔn)上市。2、哺乳動物細(xì)胞株系

CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞。核型：2n=20～22。

貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)基：DEME培養(yǎng)基0.1mmol/L次黃嘌呤，0.1mmol/L胸苷，10%小牛血清，

加入脯氨酸。BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的。成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。

貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準(zhǔn)用于人體。SP2/0-Ag14：通過融合的方法，從有羊抗紅細(xì)胞活性的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag亞克隆中分離獲得。

能耐受8氮鳥嘌呤20μg/ml但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞和抗體。3、昆蟲細(xì)胞株系

Sf-9:

1983年從親代IPLB—SF21AE中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。Sf21：是從秋黏蟲（Spodopterafrugiperda，fallarmyworm)卵巢細(xì)胞中分離得到的，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因。TN-5B1-4：是從粉紋夜蛾（Trichoplusiani，TN）卵細(xì)胞勻漿中分離得到的，無血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表達(dá)重組蛋白的能力比SF9細(xì)胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。四、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選

在生產(chǎn)中采用更多的更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。被用構(gòu)建工程細(xì)胞的動物細(xì)胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細(xì)胞。⒈載體：(1)病毒載體牛痘病毒（用構(gòu)建多價(jià)疫苗)腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(用于基因治療)桿狀病毒(用于外源基因表達(dá))(2)質(zhì)粒載體

穿梭載體腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組的105%，DNA兩端各有一個反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子，E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時往往除去這個2.2kb的片段，使得載體的裝載量提高到4kb以上,E1區(qū)負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制也常被刪除，但有特殊要求。L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。SV40的基因組DNAt/T基因編碼病毒的小抗原和大抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān).SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細(xì)胞含有105個病毒DNA拷貝，十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白SV40DNAoriVP2TVP3VP1t

AprorigptSV40oripV2-GPTpBR322SV40pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細(xì)菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。利用SV40DNA載體表達(dá)外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細(xì)菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染牛痘病毒目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒,其基因組上插入了一個可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源基因整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒啟動子T7RNA聚合酶基因T7啟動子外源基因細(xì)菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集桿狀病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn)：①雙鏈DNA，易重組②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成。③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%～30%；⑤用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達(dá)外源基因。穿梭載體在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增。都含有如下基本成分：①允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件（TATA框和CAAT框）。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。

neo基因，編碼的氨基葡萄糖苷３‘磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）能使一種氨基葡萄糖苷類擴(kuò)生素——新霉素磷酸化而失活。

綠色熒光蛋白基因（GFP）④有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。二氫葉酸還原酶基因（dhfr）與目的基因重組在一起，培養(yǎng)基中添加氨甲喋呤時可提高表達(dá)量。哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr-細(xì)胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05mMMTX培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5mMMTX0.25mMMTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴(kuò)增至100拷貝

⒉基因載體的導(dǎo)入基因載體導(dǎo)動物細(xì)胞常用方法是：磷酸鈣沉淀法電穿孔法

磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。五、細(xì)胞庫的建立生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個細(xì)胞庫：⒈原始細(xì)胞庫⒉生產(chǎn)用細(xì)胞庫⒈原始細(xì)胞庫貯存時須有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括：①該細(xì)胞系的歷史②該細(xì)胞系的特性③對各種有害因子的檢查結(jié)果⒉生產(chǎn)用細(xì)胞庫從原始細(xì)胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個安瓶來即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增再分裝儲存形成細(xì)胞庫。需建擋案，進(jìn)行無菌性無細(xì)胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代數(shù)。第四節(jié)動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基細(xì)胞體外培養(yǎng)基本條件:①無菌②營養(yǎng)充足,防止有害物質(zhì)③氧氣④隨時清除代謝有害物質(zhì)⑤良好的生存外環(huán)境⑥及時分種一、動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件⒈器材的清洗和消毒⑴器材的清洗浸泡、刷洗、泡酸、沖洗⑵器材的消毒滅菌物理消毒化學(xué)消毒⒉水質(zhì):電阻值大于18MΩ,去熱原。⒊pH:7.2～7.4⒋滲透壓:290～300mOsm/kg⒌溫度:37±0.5C⒍空氣:氧的飽和質(zhì)60%,氧分壓4～0.7kPa二、動物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成分3類:⒈天然培養(yǎng)基⒉合成培養(yǎng)基⒊無血清培養(yǎng)基⒈天然培養(yǎng)基

血清、羊水、腹水等,成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定⒉合成培養(yǎng)基DME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640⑴氨基酸⑵維生素⑶糖類⑷無機(jī)鹽⑸其它成分添加小牛血清：添加小牛血清的作用⑴提供生長因子和激素⑵提供貼附因子和伸展因子⑶提供結(jié)合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素⒊無血清培養(yǎng)基①提高重復(fù)性②減少微生物污染③供應(yīng)充足穩(wěn)定④產(chǎn)品易純化⑤避免血清因素對細(xì)胞的毒性⑥減少血清中蛋白對生物測定的干擾無血清培養(yǎng)基加入添加劑⑴生長因子和激素⑵結(jié)合蛋白⑶貼附因子和伸展因子⑷有利細(xì)胞生長的因子和元素第五節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)方法和操作方式一、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法依細(xì)胞種類:原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)依培養(yǎng)器和方式:靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定床或流化床培養(yǎng)從生產(chǎn)實(shí)際分為:

懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)⒈懸浮培養(yǎng)讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。適用于懸浮細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，培養(yǎng)條件均一，傳至和傳氧好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。缺點(diǎn)：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌和氣升式。⒉貼壁培養(yǎng)讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達(dá)到高密度細(xì)胞。缺點(diǎn)：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。⒊貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）

⑴微載體培養(yǎng)葡聚糖類、聚苯乙烯類、膠原類優(yōu)點(diǎn)：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積，載體體積較小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的特長。⑵包埋和微囊培養(yǎng)細(xì)胞被包埋在凝膠載體或微囊內(nèi)優(yōu)點(diǎn)：包埋或包裹在凝膠載體和微曩內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細(xì)胞密度；通過控制微曩膜的孔徑可使產(chǎn)品濃縮在微曩內(nèi)有利于下游處理；可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)⑶結(jié)團(tuán)培養(yǎng)用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、節(jié)省微載體用量。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式⒈分批式培養(yǎng)

分批式培養(yǎng)是指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，同時產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。0時間分批分批式培養(yǎng)過程的特征營養(yǎng)物廢、產(chǎn)物PH、溫度、DO2、流加式培養(yǎng)先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在此過程中隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。0時間流加圖流加式培養(yǎng)過程的特征PH、溫度、DO廢、產(chǎn)物營養(yǎng)物3、半連續(xù)式培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱為反復(fù)分批式培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。4、連續(xù)式培養(yǎng)

連續(xù)式培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)器液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。

5、灌流式操作當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷的補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。與連續(xù)式培養(yǎng)不同：過程中不取出細(xì)胞，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營養(yǎng)不斷的狀態(tài)。液位控制細(xì)胞懸液細(xì)胞新鮮培養(yǎng)基收液過濾器細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)灌注速度，可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平的狀態(tài)下。表不同培養(yǎng)方式對CHO細(xì)胞生產(chǎn)人組織血纖維溶酶原激活劑（tPA)產(chǎn)量和活性的影響第六節(jié)動物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其

檢測控制系統(tǒng)一、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及其基本結(jié)構(gòu)⒈攪拌式生物反應(yīng)器⒉氣升式生物反應(yīng)器⒊中空纖維式生物反應(yīng)器⒋透析袋或膜式生物反應(yīng)器⒌固定床或流化床式生物反應(yīng)器攪拌式生物反應(yīng)器適用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊培養(yǎng)及結(jié)團(tuán)培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器主要用于懸浮細(xì)胞的分批培養(yǎng)

與攪拌式生長反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，反應(yīng)器內(nèi)沒有機(jī)械運(yùn)動部件，因而細(xì)胞損傷率比較低；同時由于采用直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細(xì)胞和營養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基中。

在氣升式生物反應(yīng)器中，溶氧的控制可以通過自動調(diào)節(jié)進(jìn)入空氣的速率來實(shí)現(xiàn)；PH值可通過在進(jìn)氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。

氣體混合物從底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的中央導(dǎo)流管使得中央導(dǎo)流管側(cè)的液體密度低于外部區(qū)域從而形成循環(huán)。內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)中空纖維式生物反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：占地??；產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高；成本低。缺點(diǎn)：不能重復(fù)使用；不能耐高壓蒸汽滅菌；難以取樣檢測。既適用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞的密度最高可達(dá)109/ml數(shù)量級。中空纖維管生物反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。平床式中空纖維式生物反應(yīng)器透析袋或膜式生物反應(yīng)器既可培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也可培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：使細(xì)胞達(dá)到很高密度；操作可隨意組合；分離提純。固定床或流化床式生物反應(yīng)器多級流化床式生物反應(yīng)器專用于比重較大的多孔微球的培養(yǎng)。氣體交換氧氣回流收獲營養(yǎng)液泵反應(yīng)塔加熱器PH傳感器TDOCO2培養(yǎng)液通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動不斷提供給細(xì)胞必要的營養(yǎng)成分，使細(xì)胞得以在微粒中生長；同時，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。

循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需的氧。CellGenplus生物反應(yīng)器通氣攪拌與固定床結(jié)合既可培養(yǎng)貼壁細(xì)胞又可培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。二、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的

檢測控制系統(tǒng)⒈培養(yǎng)過程需檢測的物化參數(shù)直接在線檢出取樣離線檢測檢測后計(jì)算⒉主要參數(shù)的檢測和控制方法⒉主要參數(shù)的檢測和控制方法⑴溫度：電阻溫度計(jì)⑵pH：復(fù)合式參比電極①在培養(yǎng)初期，控制進(jìn)入培養(yǎng)基的CO2量②當(dāng)細(xì)胞密度提高后控制NaHCO3的量⑶溶氧①改變進(jìn)氣的組成②加大通氣流量③適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速④采用在反應(yīng)器外通氣

⑷攪拌：100r/min⑸進(jìn)出液流量⑹其它：罐壓、液位等。迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在哺乳動物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b干擾素 g干擾素凝血因子VIII 凝血因子IX促紅細(xì)胞生成素（EPO） 生長因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA） 第七節(jié)動物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例一、類淋巴細(xì)胞干擾素Na-IFN-α：利用從Burkitt淋巴瘤的患者獲取的Namalva細(xì)胞生產(chǎn)。首先由英國的Wellcome公司Fante和Finter等開發(fā)成功，擴(kuò)大至8000L罐生產(chǎn)。1986年在英國批準(zhǔn)進(jìn)入市場，商品名“Wellferon”，后被日本引進(jìn)，商品名為“Sumiferon”培養(yǎng)基：RPMI1640，10%小牛血清培養(yǎng)方式：攪拌式批次培養(yǎng)純化方法：（1）三氯乙酸沉析超濾膜濃縮凝膠過濾單克隆抗體親和層析（2）單克隆抗體