實(shí)驗(yàn)室常用微生物菌種分離和培養(yǎng)的簡(jiǎn)易方法

實(shí)驗(yàn)室常用微生物菌種分離和培養(yǎng)的簡(jiǎn)易方法

微生物實(shí)驗(yàn)材料，如細(xì)菌和細(xì)菌，通常需要一些方法。1.去大學(xué)微生物研究所、相關(guān)大學(xué)生物系或微生物教研室購(gòu)買(mǎi)；2.去各級(jí)防疫站、車(chē)間、兄弟學(xué)校購(gòu)買(mǎi)或要求的防疫材料。定期移植現(xiàn)有種子。但如果上述途徑都無(wú)法實(shí)現(xiàn)或由于種種原因一時(shí)得不到現(xiàn)成的菌株,那么完全可以自己動(dòng)手,進(jìn)行微生物菌種的分離和培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?對(duì)菌種的要求也不同。如果僅僅作為形態(tài)和染色的觀察,簡(jiǎn)單的生理生化測(cè)定,分離和培養(yǎng)就比較簡(jiǎn)單,如果用于具體種、屬和血清學(xué)鑒定,分離和培養(yǎng)就比較復(fù)雜。本文重點(diǎn)介紹作為一般用途即用于形態(tài)觀察和染色試驗(yàn)用的幾種常用菌種的分離和培養(yǎng)方法。1一般消毒在一般的微生物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用到的菌種有:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、青霉、曲霉、根霉、毛霉等。2準(zhǔn)備細(xì)菌運(yùn)動(dòng)實(shí)踐有些實(shí)驗(yàn),對(duì)菌種的要求并不高,如“細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀測(cè)”,實(shí)驗(yàn)要求了解鞭毛菌的運(yùn)動(dòng)情況,由于對(duì)具體的菌種無(wú)甚要求,可采用以下的方法來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料:在做“細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察”實(shí)驗(yàn)前一天,可以找一些稻草或野草,剪碎裝入三角瓶,加少量葡萄糖和氯化鈉,并加適量水,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18小時(shí)備用。這樣培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌自然不是什么純種,而是各種各樣細(xì)菌的大雜燴,但卻能滿(mǎn)足我們實(shí)驗(yàn)的要求,可觀察到各種細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方式。用上述方法培養(yǎng)的菌液不僅包括各種形態(tài)的細(xì)菌,同時(shí)還包括了各種類(lèi)型的細(xì)菌,如革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌,所以用這種活菌液作為革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)材料,效果是相當(dāng)理想的。因?yàn)槲覀兛梢酝瑫r(shí)觀察到各種形態(tài)的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌,比僅僅用大腸桿菌(革蘭氏陰性桿菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性球菌)要好得多。3細(xì)菌的分離和繁殖對(duì)于目的要求非常明確的實(shí)驗(yàn),就必須提供具體的菌種。下面介紹幾種實(shí)驗(yàn)室常用微生物菌種分離和培養(yǎng)的簡(jiǎn)便方法:3.1發(fā)酵菌種的確定大腸桿菌廣泛存在于人和溫血?jiǎng)游锏哪c道及糞便中,存在于自然界的水、土和空氣中。一般可以用生活污水或水質(zhì)較差的水溝、水池的水樣作為樣品。方法:取樣品1mL,分別注入乳糖膽鹽發(fā)酵管(內(nèi)含10mL發(fā)酵液)(約5-6支),36±1℃,24小時(shí)培養(yǎng),如有產(chǎn)氣的,接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板36±1℃,18-24小時(shí)培養(yǎng)。挑取紫黑色帶金屬光澤、紫紅色或粉紅色的可疑菌落,進(jìn)行革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管,如革蘭氏陽(yáng)性,乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣,可以基本確定為大腸桿菌。從伊紅美藍(lán)瓊脂平板上挑取已證實(shí)為大腸桿菌的菌落,接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,36±1℃,24小時(shí)培養(yǎng),4-7℃冰箱保存?zhèn)溆?。更?jiǎn)便的方法是直接挑取人畜糞便在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上劃線(xiàn)分離,后期操作同上。乳糖膽鹽發(fā)酵管:蛋白胨20克,豬膽鹽5克,乳糖10克,0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,蒸餾水1000mL,pH7.4。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示劑,分裝每管10mL,并放入一個(gè)小倒管,高壓滅菌115℃15分鐘。乳糖發(fā)酵管:除了不加膽鹽,其他同乳糖膽鹽發(fā)酵管。3.2細(xì)菌分離、漿凝固酶試驗(yàn)及結(jié)果金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界,如空氣、土壤、水、生物體、工具及食品的原輔材料中,存在于人體鼻腔、咽部黏膜,并常常引起皮膚炎癥。所以可直接用無(wú)菌棉拭在鼻、咽部采得樣品,如直接采取皮膚炎癥部位的膿血為樣品效果更佳。由于金黃色葡萄球菌具有高嗜鹽性,一般可使用含7.5%氯化鈉的培養(yǎng)基作為增菌液,它亦是一種選擇培養(yǎng)基。方法:把已采得樣品的棉拭剪入30-50mL無(wú)菌生理鹽水中,經(jīng)過(guò)充分振搖后,用無(wú)菌吸管吸取5mL接種于7.5%NaCl肉湯50mL中,混合均勻,置36±1℃溫箱中增菌18-24小時(shí),然后將增菌培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于卻普曼瓊脂平板上,36±1℃培養(yǎng)24小時(shí),金黃色葡萄球菌在卻普曼瓊脂平板上產(chǎn)生的菌落較小,分解甘露醇,菌落周?chē)庶S色。挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢,同時(shí)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,36±1℃培養(yǎng)24小時(shí)后,進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。形態(tài):本菌為革蘭氏陽(yáng)性菌,排列呈葡萄狀,無(wú)芽孢,無(wú)莢膜,致病性葡萄球菌菌體較小,直徑約0.5～1μm。(血漿凝固酶試驗(yàn):取0.25mL血漿與等量的生理鹽水混合,取待檢疑似葡萄球菌菌株24小時(shí)培養(yǎng)物一接種環(huán)接入該稀釋血漿中,放36±1℃溫箱或水浴中,每半個(gè)小時(shí)觀察一次,觀察6小時(shí),如呈現(xiàn)凝固現(xiàn)象即為陽(yáng)性。)從卻普曼瓊脂平板上挑取已證實(shí)為金黃色葡萄球菌的菌落,接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,36±1℃,24小時(shí)培養(yǎng),4-7℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.5%NaCl肉湯:蛋白胨10克,牛肉膏3克,氯化鈉75克,蒸餾水1000mL,pH7.4。將上述成分加熱溶解,校正pH,分裝試管或三角燒瓶,高壓滅菌115℃15分鐘。卻普曼瓊脂平板:牛肉膏10克,蛋白胨10克,甘露醇10克,氯化鈉75克,瓊脂15克,蒸餾水1000mL,0.4%酚紅水溶液6mL。將上述各成分除酚紅外,加熱溶解調(diào)節(jié)pH至7.4,加上酚紅溶液,分裝于三角燒瓶,以115℃15分鐘高壓滅菌,臨用前傾注平板。3.3馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液母菌種酵母菌與人類(lèi)關(guān)系密切,在釀造、食品和醫(yī)藥工業(yè)等方面均有重要應(yīng)用。酵母菌主要分布在含糖質(zhì)較高的偏酸性環(huán)境,如果品、蔬菜、花蜜和植物葉子上,特別是葡萄園和果園的土壤中。方法:取幾顆鮮葡萄或少許蘋(píng)果皮(勿洗),用無(wú)菌生理鹽水沖洗,或直接浸入適量無(wú)菌生理鹽水中,經(jīng)充分振搖,然后用接種環(huán)沾取少量上述生理鹽水于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板劃線(xiàn),25～28℃,4～7天培養(yǎng),挑取少量乳白粘稠的單個(gè)菌落鏡檢,如發(fā)現(xiàn)單個(gè)個(gè)體較大(比細(xì)菌要大得多),圓形或卵圓形,有的有出芽狀的,在高倍鏡下可隱見(jiàn)其中的細(xì)胞核,初步可確定為酵母菌。挑取少量菌落接種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面,25～28℃,4～7天培養(yǎng),置4～7℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ捎诮湍妇^易得到,一般可直接使用市售的鮮酵母或干酵母。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200克,葡萄糖20克,自來(lái)水1000mL。將馬鈴薯洗凈,去皮,切成小塊,加水煮沸30分鐘,經(jīng)紗布過(guò)濾,濾液加水至1000mL,加入葡萄糖和瓊脂,熔解后分裝三角瓶,8磅(112.6℃)20分鐘滅菌。3.4分生孢子穗的分離培養(yǎng)青霉是產(chǎn)生青霉素的重要菌種,廣泛分布于空氣、土壤和各種物品上,常常生長(zhǎng)在腐爛的柑橘皮上呈青綠色。一般可以從發(fā)霉的面包或霉變的柑橘上分離取得。方法:挑取霉變面包或柑橘上的青綠色孢子,接種到察氏培養(yǎng)基平板上,25～28℃,4～7天培養(yǎng),挑取部分菌落于載玻片上鏡檢或直接在低倍鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)分生孢子穗為掃帚狀的便能確定。分生孢子穗因分生孢子梗的著生方式不同可以分為四類(lèi):即一輪青霉:分生孢子梗只有一輪分枝;二輪青霉:分生孢子梗產(chǎn)生兩輪分枝;多輪青霉:分生孢子梗具三輪以上分枝;不對(duì)稱(chēng)青霉:分生孢子梗上不對(duì)稱(chēng)地產(chǎn)生或多或少輪層的分枝。挑取少量分生孢子接種察氏培養(yǎng)基斜面,25～28℃,4～7天培養(yǎng),置4～7℃冰箱保存?zhèn)溆?。察式培養(yǎng)基:蔗糖30克,NaNO33克,K2HPO41克,MgSO4·7HO20.5克,KCl0.5克,FeSO40.01克,瓊脂15克,蒸餾水1000mL,高壓滅菌115℃15分鐘。3.5黃曲霉、黑曲霉、米曲霉的初篩結(jié)果曲霉廣泛分布在谷物、空氣和各種有機(jī)物品上,生長(zhǎng)在花生和大米上的曲霉,有的能產(chǎn)生對(duì)人體有毒的真菌毒素。方法:取2-3顆霉變的花生米(霉變的花生幾乎均含有黃曲霉),把花生掰開(kāi),放入裝有10mL無(wú)菌生理鹽水的試管中,振搖幾分鐘后,然后用接種環(huán)沾取少量上述生理鹽水接種于察氏培養(yǎng)基平板,25～28℃,4～7天培養(yǎng),挑取部分菌落于載玻片上鏡檢或直接在低倍鏡下觀察。如發(fā)現(xiàn)分生孢子穗為頭狀,并具有足細(xì)胞,可基本確定為曲霉。根據(jù)分生孢子穗的顏色可初步確定為黃曲霉、黑曲霉或米曲霉。挑取少量分生孢子接種察氏培養(yǎng)基斜面,25～28℃,4～7天培養(yǎng),置4～7℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.6發(fā)酵或干霉根霉在自然界分布很廣,空氣、土壤以及各種器皿表面都有存在。并常常出現(xiàn)于淀粉質(zhì)食品上,引起饅頭、面包、甘薯等發(fā)霉變質(zhì),或造成水果蔬菜腐爛。由于根霉是食用甜酒曲的主要菌種,亦可從酒曲中分離到。方法:把酒曲(可從食品店購(gòu)得)碾碎,(或用霉變的饅頭、面包),稱(chēng)取1克,放入9mL無(wú)菌生理鹽水,搖勻,制成1:10的稀釋度;用無(wú)菌吸管從1∶10的稀釋度中吸取1mL注入9mL無(wú)菌生理鹽水,搖勻,制成1:100的稀釋度。用無(wú)菌吸管從1∶100的稀釋度中吸取1mL注入9mL無(wú)菌生理鹽水,搖勻,制成1∶1000的稀釋度;然后用接種環(huán)沾取少量1:1000的稀釋度的稀釋液接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板,25～28℃,4～7天培養(yǎng)。挑取部分菌落于載玻片上鏡檢或直接在低倍鏡下觀察。如發(fā)現(xiàn)有黑色的孢子囊,有假根,孢子囊梗直接從假根處生出,有匍匐枝,即為典型的匍枝根霉,即黑根霉,俗稱(chēng)面包霉、米根霉。挑取少量孢囊孢子接種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面,25～28℃,4～7天培養(yǎng),置4～7℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.7馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的制備毛霉分布于土壤、肥料中,也常見(jiàn)于水果,蔬菜以及各種淀粉性食物和谷物上,引起霉腐變質(zhì)。方法:取豆腐胚(老豆腐或豆腐干2×2×2cm)放一小碟內(nèi),通風(fēng)保存12～24小時(shí),置15～18℃溫箱5～7天,待外觀白色菌絲長(zhǎng)遍整個(gè)豆腐胚,挑取少許菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板,25～28℃,4～7天培養(yǎng),挑取少許菌絲于載玻片上鏡檢。毛霉是低等