蛋白印跡分析技術(shù)(Western Blot)

核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù)

第一節(jié)核酸分析技術(shù)講述內(nèi)容：1、核酸電泳2、雜交技術(shù)3、PCR技術(shù)4、基因芯片一、核酸電泳（一）DNA的凝膠電泳凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。1.瓊脂糖凝膠用于分離大于200～1000bp的片段;操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高

2.聚丙烯酰胺凝膠用于分離5－500bp的片段;效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA

用于核苷酸多態(tài)性的分析

瓊脂糖凝膠電泳的基本過程材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時(shí)間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。

基本過程：制膠放入電泳槽中并加入電泳緩沖液取出梳子將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中一定電壓條件下電泳合適的時(shí)間后停止電泳取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果

注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V)DNA分子的有效分離范圍（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2影響DNA在凝膠中遷移速率的因素：

1DNA分子的大小2構(gòu)象3凝膠濃度4電壓5緩沖液瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡過程中DNALadder的形成PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析特殊的凝膠電泳倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量10～2000kb的DNA分子；鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子

基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。

（二）RNA電泳二核酸雜交技術(shù)（一）SouthernBlot原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

SouthernBlot操作步驟：DNA瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或顯色原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。

（二）NorthernBlot

操作過程mRNA提取甲醛變性電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光（三）探針標(biāo)記技術(shù)1標(biāo)記物：放射性和非放射性兩種放射性：非放射性：生物素、地高辛素、熒光素

2、標(biāo)記方法

（1）切口平移法

（2）隨機(jī)引物法（3）末端標(biāo)記法（4）單鏈DNA探針標(biāo)記（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法

32P、35S和3H

三PCR技術(shù)PCR(Polymerasechainreaction)是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。

Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎；目的:用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。（一）原理：雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA－－－變性↓與一對寡核苷酸引物（5’，3’）降低溫度退火DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火↓適溫延伸5’/3’引物形成新鏈變成4條鏈DNA－－延伸↓第二輪：變性—退火—延伸呈指數(shù)增長理論值：一輪一倍10輪103=1000倍

20輪10630輪109

理論模板擴(kuò)增30輪1ng1g

實(shí)際模板擴(kuò)增30輪1ng10

g1TaqDNA聚合酶：水生棲熱菌(thermus

aquaticus,Taq)的DNA聚合酶

①5’

3’DNA聚合酶活性；

②無3’

5’外切酶活性，

35輪0.25%錯配，與原始模板有差別；最適聚合酶溫度72℃，選擇72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min

變性溫度：≤95℃使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性（二）基本要素pfuDNA聚合酶

耐熱5’

3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精確度：pfu>Taq但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差文獻(xiàn)報(bào)道：Taq+pfu會起到較好效果

2.引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每條10-50pmol/100l

◆設(shè)計(jì)原則：（1）靠近5'上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同

3'下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ)，與負(fù)鏈相同正鏈5'—————3'——上游Primer

——下游Primer負(fù)鏈3'—————5'

例如：

IL-3正鏈

5'GCTCCATGACCCAGGCGATCTTTTGAGTCCAA3'

負(fù)鏈3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'

上游~：與其相同下游~：先寫出相應(yīng)負(fù)鏈3'→5'然后倒過來5'→3'

所以負(fù)鏈Primer：5'-TTggACTCAAAAgAT

CgC-3'（2）Primer本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)如：GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意減少Primer間互補(bǔ)序列導(dǎo)致2個(gè)Primer形成dimer一般不要超過3個(gè)互補(bǔ)bp如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

修飾

如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果

突變：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：絕不可以在3'端進(jìn)行上述改造

∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補(bǔ)→不能延伸

（4）Primer5’未端可修飾、突變:

（5）primer5’端增加堿基

①內(nèi)切酶識別點(diǎn)：

（G）GAATTC

GCTCCATGACCCAG

↑保護(hù)bp

對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護(hù)bP數(shù)量不同

EcoRI1BglII2-3

XbaI2-3HindⅢ>3

BamHI2-3PstI>4

XhoI>4NotI>10

如果所用保護(hù)bp數(shù)量不合適→影響內(nèi)切酶消化→影響下步克隆

∵未切開，連接不上

②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。3.模板：

可選：DNAmRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNADNA包括：質(zhì)粒噬菌體染色體DNA較小較大①目的gene是單拷貝變性較易變性較難②非常大，變性難模板用量Plasmid:lngChromosome:300-500ng注意：防止交叉污染4.dNTP：四種脫氧核苷酸，基本原料終濃度：50

M注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會失效5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+不同的酶需不同Mg2+Taq：較少，Mg2+對反應(yīng)影響很大，0.5-1.5mM終濃度pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍外界影響：EDTA鰲合Mg2+∴選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+有效濃度?！嗳绻麛U(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑（2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑；Tm↓退火T↓若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：500nt1min500nt－－3min一般：40－60sec

6.溫度和時(shí)間：（三）PCR技術(shù)的應(yīng)用1.基因檢測：2.基因克隆化3.DNA突變4.DNA序列分析四、基因芯片利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于DNA、RNA的研究背景資料

基因芯片（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）就是利用點(diǎn)樣機(jī)等機(jī)械裝置，在玻璃等支持物表面整齊地點(diǎn)上高密度的、成千上萬個(gè)“點(diǎn)”，每個(gè)“點(diǎn)”含有可與一種基因雜交的一條ＤＮＡ探針。由于芯片上有序地排列著ＤＮＡ探針，因此也被稱為微陣列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加樣品后，在合適的條件下，樣品中含有的各種核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就與相應(yīng)的探針雜交。由于核酸片段上已標(biāo)記有熒光素，激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度就與樣品中所含有的相應(yīng)核酸片段的量成正比，也就代表該基因的表達(dá)量。經(jīng)激光共聚焦掃描儀等裝置掃描后，所獲得的信息經(jīng)專用軟件分析處理，即可獲得成千上萬種基因的表達(dá)情況。正因?yàn)檫@種特點(diǎn)，基因芯片技術(shù)已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。操作流程

（1）探針的設(shè)計(jì)、合成與芯片的制作（商品化產(chǎn)品）；（2）靶基因樣品的制備；

靶基因的制備：RT-PCR（設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組）標(biāo)記方法：分別進(jìn)行熒光素標(biāo)記如：Cy3和Cy5（3）生化雜交反應(yīng)；與常規(guī)的分子雜交過程基本相似

封閉預(yù)雜交雜交洗脫（4）雜交信號的檢測與結(jié)果的分析

激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號，計(jì)算機(jī)分析

基因芯片的應(yīng)用用于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究

舉例：美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細(xì)胞和未處理的T細(xì)胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片段雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)的基因，其中11個(gè)是被熱誘導(dǎo)的，6個(gè)是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證實(shí)，其中3個(gè)是未報(bào)導(dǎo)的新基因。第二節(jié)蛋白質(zhì)分析技術(shù)講述內(nèi)容：一、WesternBlot

二、ELISA三、免疫熒光技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù)

五、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)一WesternBlot1原理：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。

2操作過程SDS電泳轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉一抗洗滌酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影

Hours04816

WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20

Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol

0h4h8h16h

WesternBlotanalysisofcytochromeCrelease.

Cytochromecreleasefrommitochondriatocytosolingossypol-treatedIM-9/Bcl-2cells.Cellsweretreatedwith10μMgossypolfordifferenttimes,cytosolandmitochondrialproteinweresubjecttoSDSfollowedbyimmunoblotwithcytochromecspecificantibody.Cyto-CX-Protein3注意的問題（1）蛋白質(zhì)電泳常用SDS：單一亞基組成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套（2）轉(zhuǎn)膜戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫钄噢D(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極排去濾紙、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置（3）封閉用5％脫脂奶粉或3％BSA（含0.1％Tween20TBS或PBS配制）時(shí)間：室溫2h或4oC過夜（4）顯色或顯影顯色辣根過氧化物酶：底物為DAB堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT化學(xué)發(fā)光顯影最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定

（5）膜的再利用

化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用StrippingBuffer洗滌后（洗滌Buffer:62.5mmpH6.7的Tris-HCI含2％SDS和100mm的

－2ME）用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交1原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。二、ELISAELISA常用的酶和底物

辣根過氧化物酶，底物為OPD,深桔黃色，檢測波長492nmTMB，藍(lán)綠色，檢測波長450nm堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－消基苯磷酸酯）,黃色檢測波長405nm

ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間

包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml封閉：37oC2h或4oC過夜（3％BSA）樣本反應(yīng)時(shí)間：37oC45min-1h酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間：37oC45min-1h顯色時(shí)間：15min(避光）設(shè)對照可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?/p>

2類型（1）間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。方法：抗原包被封閉待檢抗體洗滌酶標(biāo)二抗洗滌顯色反應(yīng)終止反應(yīng)ELISAReader檢測OD值(2)雙抗體夾心法測抗原是檢測抗原最常用的方法。

只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。常用的組合：單克隆抗體＋多克隆抗體單克隆抗體＋單克隆抗體

后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。用途：測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測。雙抗體夾心法測抗原的方法：捕獲抗體包被封閉（3％BSA）待測抗原洗滌（含0.1％Tween的PBS)酶標(biāo)單抗或多抗洗滌顯色檢測(3)競爭法測抗原1）抗體固相測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。方法：抗體包被封閉同時(shí)加入待測抗原和酶標(biāo)抗原洗滌酶底物顯色ELISAreader檢測2）抗原固相測抗原其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法:a:抗原包被96孔板；b:封閉;c:待測抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間；d:加入96孔板e:洗滌f：加入酶標(biāo)二抗g：洗滌h：顯色和檢測如臨床血清樣本的檢測以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測（4）IgM抗體的檢測1）間接法：間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。方法a:抗原包被96孔酶標(biāo)板；b:封閉;c:待測血清與A蛋白反應(yīng)一定時(shí)間后離心d:吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板e:洗滌f：加入酶標(biāo)抗IgM的抗體g：洗滌h：顯色和檢測2）捕獲包被法（夾心法）先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（包括針對抗原特異性的IgM和非特異性的IgM)。然后加入相應(yīng)抗原，繼而加入針對抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的IgM含量成正相關(guān)。方法：

a:抗人IgM抗體包被96孔酶標(biāo)板；b:封閉;c:加入待測血清；d:洗滌96孔酶標(biāo)板e:加入相應(yīng)抗原f：加入抗原特異的酶標(biāo)抗體g：洗滌h：顯色和檢測（5）ABS-ELISA技術(shù)（AvidinBiotinsystem-ELISA原理親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基有一個(gè)生物素分子結(jié)合點(diǎn)。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種材料所標(biāo)記，成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個(gè)親