純化層析介質(zhì)培訓(xùn)

純化層析介質(zhì)培訓(xùn)2015.10序言根據(jù)生物分子特性特性的差異，使用純化技術(shù)分離純化生物分子：分子特性純化技術(shù)生物性識(shí)別親和層析電荷離子交換層析疏水性疏水層析反相層析分子大小凝膠過(guò)濾層析色譜純化的分離原理EPO純化使用的層析介質(zhì)

填料名稱生產(chǎn)廠家親和層析BlueSepharose6FastFlowGE超濾Biomax8Millipore離子交換層析IDEAESepharoseFastFlowGE反相層析OligoR3AppliedBiosystems離子交換層析IIDEAE-SepharoseFastFlowGE凝膠過(guò)濾層析SephacrylS-200HRGE親和層析介質(zhì)什么是親和層析?親和層析是通過(guò)生物分子的生物相互作用進(jìn)行生物分子分離的一項(xiàng)液相分離技術(shù)?；靖拍睿禾禺愋越Y(jié)合典型的生物間相互作用親和介質(zhì)的組成基質(zhì)：用于吸附配基?；|(zhì)應(yīng)該具有化學(xué)惰性和物理學(xué)惰性。間隔臂：通過(guò)克服任何空間位阻效應(yīng)，提高基質(zhì)和目標(biāo)分子的結(jié)合。配基：能夠可逆的結(jié)合特定目標(biāo)分子或者目標(biāo)分子基團(tuán)的分子EPO生產(chǎn)中的親和層析介質(zhì)名稱BlueSepharose6FastFlow基質(zhì)Sepharose（瓊脂糖凝膠）配基CibacronBlue3G（辛巴藍(lán)）藍(lán)膠的光學(xué)顯微鏡照高效的色譜基質(zhì)具有理化惰性具有相當(dāng)?shù)偷姆翘禺愋晕教菤埢系牧u基基團(tuán)容易被衍生化，可以使配基共價(jià)附著在上面具有開放的孔狀結(jié)構(gòu)，保證高容量結(jié)合具有良好的流動(dòng)特性，適于快速分離在實(shí)驗(yàn)所需的條件范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性，例如高和低的pH值、去污劑和裂解試劑Sepharose瓊脂糖凝膠Sepharose是一種小球形狀的瓊脂糖，具有上述的特性瓊脂糖的部分結(jié)構(gòu)配基配基是可以可逆結(jié)合特定分子或者分子基團(tuán)的分子。配基與目標(biāo)物的結(jié)合必須具有特異性和可逆性，并且必須具有化學(xué)修飾基團(tuán)，可以使它吸附在基質(zhì)上，并且不損害它的活性。配基脫落問(wèn)題藍(lán)膠配基藍(lán)膠非特異性結(jié)合：具有基本右手螺旋的蛋白質(zhì)，包括白蛋白、EPO等，都可以結(jié)合。這一結(jié)構(gòu)類似于5’AMP，有親和層析的效果——NDP依賴脫氫酶和ATP依賴激酶。含有SO3Na，會(huì)形成離子鍵。含有大量苯環(huán)結(jié)構(gòu)，形成疏水鍵。SepharoseNNNHSO3NaSO3NaNH2SO3NaNHOOONHNBlueSepharose6FastFlow親和層析介質(zhì)特性

(BlueSepharose6FastFlow)Totalbindingcapacity>18mghumanserumalbumin/mldrainedmediumLiganddensityapprox.7μmolCibacronBlue3G/mldrainedmediumAverageparticlesize90μm(45to165μm)Beadstructure6%highlycross-linkedagaroseLinearflowvelocity300cm/h(25°C,XK50/30column,15cmbedheight)pHstabilitylongtermshortterm(CIP)4to123to13Chemicalstability7daysat40°Cin70%ethanol6Mguanidinehydrochloride8MUreaTemperaturestability4°Cto40°CAutoclavable121°Cfor15minindistilledwater？為什么用300目篩布目數(shù)，就是孔數(shù)，就是每平方英寸上的孔數(shù)目。目數(shù)越大，孔徑越小。一般來(lái)說(shuō)，目數(shù)×孔徑（微米數(shù)）＝15000由于存在開孔率的問(wèn)題，也就是因?yàn)榫幙椌W(wǎng)時(shí)用的絲的粗細(xì)的不同，不同的國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)也不一樣，目前存在美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)、英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)和日本標(biāo)準(zhǔn)三種，其中英國(guó)和美國(guó)的相近，日本的差別較大。我國(guó)使用的是美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，也就是可用上面給出的公式計(jì)算。300目篩布的孔徑為48μm左右200目篩布的孔徑為75μm左右超濾系統(tǒng)什么是超濾？截留分子量1kD-1000kD

膜孔徑0.001-0.10μm切向流過(guò)濾（TFF）過(guò)濾方式普通過(guò)濾(NFF)切向流過(guò)濾(TFF)濾芯形式或“死端過(guò)濾”流向是垂直于過(guò)濾介質(zhì)的

所有的液體全部透過(guò)過(guò)濾介質(zhì)

顆粒被截留在過(guò)濾膜內(nèi)部或表面交叉流動(dòng)過(guò)濾

流向是切向(平行)于過(guò)濾膜表面的一小部分液體透過(guò)過(guò)濾介質(zhì)截留的顆粒從膜的表面被”掃除””普通過(guò)濾(死端過(guò)濾)液體流向膜表面濃差極化切向流過(guò)濾(錯(cuò)流過(guò)濾)切向流速溶液濃度Cb膜表面膜表面濃度Cw超濾操作回流液虹吸補(bǔ)液調(diào)節(jié)閥泵超濾膜透過(guò)液？問(wèn)題超濾是根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離的，我們實(shí)際使用8KD的超濾膜，而EPO蛋白的分子量為30.4KD，我們?yōu)槭裁床贿x用30KD的膜進(jìn)行超濾？超濾膜截留分子量截留分子量（MWCO:molecularweightcutoff）是使用分子量大小表示的超濾膜的截留性能。如膜對(duì)被截留物質(zhì)的截留率大于90％時(shí)，就用被截留物質(zhì)的分子量表示膜的截留性能超濾膜截留分子量KD%水通量（NWP)用于測(cè)試超濾膜的清洗效果水通量：指單位壓力下，單位時(shí)間通過(guò)單位膜面積的水的體積或質(zhì)量簡(jiǎn)稱：NWP，單位是：升/平米/小時(shí)/巴，即單位膜面積，單位壓力下通過(guò)膜的水的流量：

NWP=水流量X溫度校正因子/TMP/膜面積

其中膜穿透壓力TMP=（Pin+Pout）/2-Pp，即進(jìn)口壓力加出口壓力的平均值減去濾過(guò)液壓力。水通量（NWP)R=透過(guò)速度ml/minPin=進(jìn)口壓psi(bar)Pout=出口壓psi(bar)Pp=透過(guò)口壓psi(bar)T=水溫°CF

=NWP水溫校正因素NWP=R×FA×Pin+Pout

2－Pp水通量（NWP)當(dāng)膜堆使用了一次之后，所測(cè)出的NWP不應(yīng)低于最初標(biāo)準(zhǔn)的80％；在反復(fù)使后，每次NWP的衰減不應(yīng)超過(guò)10％。如果NWP衰減幅度較大，說(shuō)明清洗效果不好，應(yīng)該試用其它的清洗劑和清洗程序。超濾膜特性

（Biomax8）截留分子量8KD膜面積0.5m2處理量2L或更大膜材質(zhì)聚醚砜離子交換層析介質(zhì)什么是離子交換層析？離子交換層析：是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進(jìn)行分離純化的一種方法。平衡上樣低鹽高鹽再生陰離子交換層析原理圖陰離子交換層析原理圖離子交換層析I依靠離子強(qiáng)度逐步增強(qiáng)，對(duì)蛋白進(jìn)行分離純化DEAE骨架+OH-目標(biāo)蛋白-Cl-離子交換層析II利用蛋白的等電點(diǎn)特性，在相同的溶液環(huán)境中電荷性質(zhì)及數(shù)量不同，對(duì)蛋白進(jìn)行分離純化DEAE骨架+OH-目標(biāo)蛋白-H+兩性電解質(zhì)不同蛋白質(zhì)在特定pH值下的帶電特性離子取代順序電荷高者離子大者濃度大者>+++>++++++>+++離子交換層析介質(zhì)的類型按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同膠體-++++++++++++膠體+------------陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑帶負(fù)電荷與陽(yáng)離子交換帶正電荷與陰離子交換強(qiáng)離子交換劑與弱離子交換劑功能團(tuán)是否參與電荷的平衡載量是否隨pH值變化較大載量在很寬的pH范圍內(nèi)保持恒定；其功能團(tuán)就象是強(qiáng)酸強(qiáng)堿鹽，如果將強(qiáng)陰離子膠放在某一個(gè)緩沖液中，使用0.1NaOH去滴定，見(jiàn)下圖（Q和SP），則因?yàn)閺?qiáng)酸強(qiáng)堿鹽的功能團(tuán)不會(huì)參與電荷的平衡，所以其pH變化直接由0.1NaOH決定，pH直接變化到很高。載量隨

pH

而變化；其功能團(tuán)就象是弱酸弱堿鹽，0.1NaOH去滴定時(shí)，見(jiàn)下圖（DEAE和CM），則因?yàn)槿跛崛鯄A鹽的功能團(tuán)會(huì)解離，參與電荷的平衡，所以表現(xiàn)為有一定的緩沖能力，pH緩慢變化。強(qiáng)離子交換劑弱離子交換劑強(qiáng)離子交換劑與弱離子交換劑強(qiáng)離子交換劑弱離子交換劑可引入的解離基團(tuán)陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑磺酸基-SO3-H+季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]磷酸根-O-PO2H2亞磷酸根-O-POH2叔胺、仲胺、伯胺基團(tuán)強(qiáng)酸型中等酸型羧基-COOH弱酸型強(qiáng)堿型弱堿型離子交換層析介質(zhì)特性

（DEAESepharoseFastFlow）是一種弱陰離子交換介質(zhì)離子交換基團(tuán)為二乙基氨乙基（diethylaminoethylgroup，即DEAE）：-OCH2CH2N+(CH2CH3)2離子交換層析介質(zhì)特性

（DEAESepharoseFastFlow）IonexchangetypeWeakanionTotalionic