第8章 第1節(jié) 基因診斷(3,LMJ)

第八章基因診斷與基因治療基因診斷（genediagnosis）：——從基因水平探測和分析疾病的起因?；蛑委煟╣enetherapy）：——從基因水平干涉和矯正疾病造成的紊亂。1多數(shù)非感染性疾病發(fā)生的根本原因是基因結(jié)構(gòu)的變異或表達(dá)水平的異常；感染性疾病則是病原體入侵在體內(nèi)表達(dá)外源性基因所致。授課老師：江黎明1*2一、基因診斷的概念和特點二、基因診斷的主要技術(shù)方法三、常見的基因異常及其檢測四、疾病的基因診斷(自習(xí))五、基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第一節(jié)基因診斷(gene

diagnosis)*3

基因診斷通常是指利用分子生物學(xué)的方法技術(shù)，直接檢測體內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)變異或RNA的水平變化，從而對疾病作出診斷的方法。一、基因診斷的概念和特點（一）概念

適用于遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病的診斷，以及個體識別和親子鑒定等法病學(xué)領(lǐng)域。*4（二）特點--以已知基因作為檢測對象（l）特異性強：直接檢測導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因變化；（2）靈敏度高：所采用的分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)都具有信號放大作用；（3）取樣便利：一般不受組織或時相的限制；（4）早期診斷：易在疾病尚無臨床表現(xiàn)時作出診斷；（5）應(yīng)用廣泛：可檢測自體基因和外源基因。*一、基因診斷的概念和特點(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）(四)DNA分子多態(tài)性（DNApolymorphism）分析(五)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析(六)顯微切割（microdissection）技術(shù)5(七)DNA序列測定（DNAsequencing）二、基因診斷的主要技術(shù)方法5*6(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術(shù)

Southern/DNA印跡、Northern/RNA印跡(第七/六章)和Western/蛋白質(zhì)印跡(第九/二章)其他雜交方法:1.斑點印跡(dotblotting)與狹縫雜交2.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH)*二、基因診斷的主要技術(shù)方法71.斑點印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNA或RNA)樣品點在NC膜上，變性后與標(biāo)記探針結(jié)合，顯影或顯色，密度測量，與對照品比較確定所測核酸量的高低。方法：應(yīng)用：主要用于檢測細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化或者mRNA含量的變化。便于大規(guī)模檢測和篩選；容易出現(xiàn)假陽性。特點：7*Slot-blot結(jié)果GS-670型光密度掃描儀(Bio-Rad)

92.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)組織或細(xì)胞(新鮮組織切片、細(xì)胞涂片或石蠟切片)樣品做適當(dāng)處理(如固定劑固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，標(biāo)記探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸雜交。方法：應(yīng)用：被檢測基因或mRNA在細(xì)胞內(nèi)的檢測及定位。特點：不需提取被檢核酸，可確定被檢核酸細(xì)胞內(nèi)定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH)用于特定基因的定位及其缺失、擴增或重排的檢測。9*10*11原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴增熒光原位雜交檢測*熒光原位雜交*12133.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設(shè)計和制備與野生型或突變型基因序列片段互補的兩種探針，分別與被檢DNA進(jìn)行雜交，確定基因突變存在與否，分辨純/雜合子。方法：應(yīng)用：基因結(jié)構(gòu)變異所致疾病的診斷。特點：雜交條件要求嚴(yán)格，以避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。*14N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHMASOH示意圖*154.DNA芯片(DNAchip)技術(shù)DNA點陣(DNAarray)——把多種已知序列的DNA片段排列在固體支持物上，同時對樣品中的多種核酸進(jìn)行檢測和分析。方法：應(yīng)用：單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因表達(dá)譜和遺傳性疾病的分析；病原微生物的大規(guī)模檢測。DNA微陣列(DNAmicroarray)——通過計算機控制點樣和圖像掃描的高密度集成探針的雜交技術(shù)。*16(二)PCR技術(shù)(第七/七章)1.PCR技術(shù)的原理以DNA分子為模板，加入與擬擴增DNA片段兩端分別互補的一對寡核苷酸鏈作為引物，在DNA聚合酶的催化下，按照半保留復(fù)制的形式分別合成兩股新的DNA互補鏈，可使兩引物間的DNA片段拷貝數(shù)增加一倍。

多次重復(fù)這一過程，可使這段DNA拷貝數(shù)隨復(fù)制次數(shù)以指數(shù)形式擴增。*二、基因診斷的主要技術(shù)方法172.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(shù)(1)DNA的微量分析

總RNA(或mRNA)ss-cDNAds-cDNAPCR擴增PCR法靈敏度高，對模板DNA純度要求不高，且樣品用量極微(如一滴血、一根頭發(fā)等)。(2)RT-PCR(reversetranscriptional-PCR)*18(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對引物(外引物、內(nèi)引物)擴增，大大提高了擴增的特異性(4)不對稱PCR(asymmetricPCR)2個引物濃度不等，一般采用50:1或100:1的摩爾比，主要獲取單鏈DNA作構(gòu)象分析或用作探針。18*19(5)多重PCR(multiplexPCR)在同反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增同一DNA樣品中的多個不同序列區(qū)域，且每對引物所擴增的產(chǎn)物長度都不同，可根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否存在某些基因片段的缺失或長度改變。(6)等位基因特異性PCR(AS-PCR)

針對等位基因的序列差異區(qū)域設(shè)計引物，使引物的3’端與等位基因序列的差異堿基對應(yīng)，僅能與突變型或野生型互補。19*20(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)技術(shù)

1)細(xì)胞和組織經(jīng)固定劑固定、蛋白酶消化，使細(xì)胞獲得適度的通透性，既利于PCR反應(yīng)試劑到達(dá)靶位，又可防止擴增產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)漏出；

2)把載玻片的靶DNA進(jìn)行常規(guī)PCR(病毒RNA的擴增用RT-PCR);

3)最后通過間接法(原位雜交)或直接法(PRC過程中加入標(biāo)記)檢測擴增產(chǎn)物。*21（8）實時熒光定量PCR

PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號；每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。*22(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析利用單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象而在中性PAGE電泳中的遷移率不同；(singlestrandcomformationpolymorphism,SSCP)22*與正常的電泳圖型對照，出現(xiàn)新條帶即可判定存在堿基變異。二、基因診斷的主要技術(shù)方法23與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。*241.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性的檢測(四)DNA分子多態(tài)性(DNApolymorphism)分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP)(variablenumberoftandemrepeats,VNTR)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)24*二、基因診斷的主要技術(shù)方法25VNTR的重復(fù)序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA):重復(fù)單元長度為6~70bp；微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA):重復(fù)單元長度為1~6bp。短串聯(lián)重復(fù)DNA(shorttandemrepeatDNA,STRDNA):重復(fù)單元長度為2~6bp。根據(jù)重復(fù)單元長度可分為：25*26不同個體間重復(fù)單元[如(CA)n/(TG)n]的拷貝數(shù)(即出現(xiàn)的頻率)不同，因而產(chǎn)生多態(tài)性，稱為VNTR多態(tài)性。VNTR多態(tài)性：限制酶識別位點限制酶識別位點26*27(五)限制酶譜分析當(dāng)某種限制酶的切點改變時(由點突變、單個堿基的插入或缺失引起)，用該種限制酶切割后得到的DNA片段的大小和數(shù)目都隨之發(fā)生變化，通過電泳分析即可作出判斷。PCR-RFLP設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。27*二、基因診斷的主要技術(shù)方法28ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC--CTTAAG-EFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點的變化*29(六)顯微切割(microdissection)技術(shù)是應(yīng)用激光捕獲顯微鏡，在高倍鏡下選擇幾個甚至一個細(xì)胞進(jìn)行分析；可用于石蠟包埋組織進(jìn)行回顧性診斷。2.染色體的顯微切割。1.組織細(xì)胞的顯微切割是切割分裂中期的染色體的目的區(qū)域，如某些斷裂或易位、倒位位點的染色體片段，再進(jìn)行后續(xù)分析。29*二、基因診斷的主要技術(shù)方法30

瑞士MIICellCut全自動激光顯微切割（熒光）系統(tǒng)

可通過紫外激光切割需要分離的組織，然后通過有黏性的Eppendorff管蓋進(jìn)行收集，這樣就可以將特定類型的細(xì)胞從組織切片上分離下來。*31可以準(zhǔn)確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細(xì)胞或組織，保持細(xì)胞內(nèi)生物分子的完整性，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分析。配有近紅外激光(波長810nm)；紫外激光(波長349nm)；紅色、綠色、藍(lán)色三種熒光濾光片。美國Arcturus公司的Veritas激光捕獲顯微分離儀*PICS

Altra

II流式細(xì)胞儀(分析分選)32*33(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術(shù)方法中最準(zhǔn)確最可靠的—種。缺點：費時、費力、費用高。33*二、基因診斷的主要技術(shù)方法34(一)點突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測(三)基因重排的檢測(四)基因擴增的檢測(五)DNA多態(tài)性的檢測(六)基因表達(dá)異常的檢測(七)病原體基因的檢測34*35(一)點突變的檢測

狹義的點突變指堿基替代，分為單點突變和多點突變；廣義的點突變還包括少數(shù)核苷酸的缺失或插入。1.已知點突變的檢測突變位點已被闡明的遺傳病，可采用PCR等位基因特異性寡核苷酸雜交(PCR/AS0H)檢測。35*三、常見的基因異常及其檢測36PCR/AS0H

檢測:(