第21章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第21章第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理：分子雜交與印跡技術(shù)的原理與應(yīng)用；末端終止法測(cè)定DNA序列的原理；PCR(polymerrasechainreaction)技術(shù)原理；酵母雙雜交技術(shù)的原理與應(yīng)用；凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的原理與應(yīng)用；染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的原理與應(yīng)用；基因診斷與基因治療。熟悉：探針、DNA點(diǎn)陣、DNA芯片、基因文庫(kù)；轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因靶向滅活、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與克隆動(dòng)物；基因診斷常用技術(shù)；基因治療的種類。了解：分子雜交技術(shù)的類別與應(yīng)用；PCR技術(shù)的發(fā)展與類別；DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù)；標(biāo)簽蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)；基因增補(bǔ)的治療程序；疾病相關(guān)基因的功能克隆與定位克?。籖NA干擾技術(shù)。復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(SouthernBlotting)（二）RNA印跡(NorthernBlotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③放射自顯影照片第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理5

5

5

5

5

5

5

5

ABababCycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。5

5

3ˊ5ˊ待擴(kuò)增片段Aa引物互補(bǔ)B鏈Bb引物互補(bǔ)A鏈a引物b引物第一周期：變性、退火、引物延伸第二周期：變性、退火、引物延伸。因?yàn)閎互補(bǔ)A鏈，a互補(bǔ)B鏈，所以b相當(dāng)于B鏈，a相當(dāng)于A鏈，所以a是b鏈引物，b是a鏈引物。bAaB第三周期：變性、退火、引物延伸bbaababaPCR原理模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C引物Tm值減5℃利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變ＧATＣ３，５，３，５，將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)

人染色體8q24·1顯微切割的PCR產(chǎn)物的原位雜交圖（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)1、概念：實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)的方式監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入含熒光基團(tuán)的探針引物，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。2、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'（熒光探針引物）*實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)（模板數(shù)）分析的原理：①、Ct值的定義：（CyCleThreslold-Ct值）每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)。（指對(duì)照與測(cè)定管，或不同條件下的PCR反應(yīng)）②、Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明，每種模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)(模板數(shù)越多，Ct值越小）。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品并可分別測(cè)得Ct值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值（或相反）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始模板拷貝數(shù)。圖示：

模板含量高，PCR循環(huán)圈數(shù)小，模板拷貝多，Ct值小含不同DNA拷貝數(shù)的樣品達(dá)到規(guī)定的熒光強(qiáng)度域時(shí)所需的擴(kuò)增循環(huán)圈數(shù)，即Ct值。每條曲線代表一種具已知拷貝數(shù)的樣品。Ct值

橫坐標(biāo)：代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)：Ct值Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)。如圖，起始模板拷貝數(shù)（對(duì)數(shù)）越小，Ct值越大Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，圖示，含拷貝數(shù)越多的樣品，Ct值越小。實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，從圖可見(jiàn)，含拷貝數(shù)越多的樣品，Ct值越小。③、RealTimePCR定量方法：絕對(duì)定量法：檢測(cè)待測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，需事先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法：在待測(cè)樣品的初始模板數(shù)（靶序列）相對(duì)于參照樣品的量的變化。如可作Ct值的比較，即比較CT法。如比較原癌基因是否擴(kuò)增，初始模板數(shù)是否增加？常用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品：最好是含有與待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒，或cDNA，還有純化的PCR產(chǎn)物等標(biāo)準(zhǔn)模板濃度通常選5個(gè)點(diǎn)，濃度呈遞減或遞增的梯度變化總之，模板DNA的量越多，熒光達(dá)到規(guī)定的閾值時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)就越少，即Ct值就越?。籐og模板濃度與PCR熒光達(dá)到規(guī)定的閾值時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)（Ct值）呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)（濃度）的標(biāo)準(zhǔn)品，可做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)得的待測(cè)樣品的Ct值就可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品（未知樣品）中所含的模板量（初始拷貝數(shù)）。第三節(jié)核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理：化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(Sanger法)一、DNA鏈末端合成終止法GATC

測(cè)序反應(yīng)

電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正極負(fù)極ddGddAddTddC鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理1、可將待測(cè)模板制作成僅差1個(gè)堿基的寡核苷酸片段；2、高分辨率的PAGE可使僅差1個(gè)堿基的寡核苷酸片段有不同的泳動(dòng)速度而分開(kāi)。模板合成的序列：5，

TTACGTCAT3‘

AATGCAGTAGATC

測(cè)序反應(yīng)

電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

負(fù)極正極ddGddAddTddC鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理ＴＴＡＣＧＴＣＡＴＡｄｄＡ×ＡＡＡ

ｄｄＡ×Ｃ

ｄｄＣ×

Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位缺少羥基，（而該羥基它可以與下一核苷酸的5ˊ磷酸形成磷酸二酯鍵），因而不能與下一個(gè)核苷酸縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。

如果在DNA的合成反應(yīng)中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。在每組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入1種ddNTP，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（高壓電泳），就可讀出序列。

雙脫氧末端終止法測(cè)序原理二、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。

ddGddAddTddC紅色熒光綠色熒光黃色熒光藍(lán)色熒光電泳DNA序列自動(dòng)分析原理及結(jié)果圖第四節(jié)基因文庫(kù)GeneLibrary基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等?；蚪M文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫(kù)第五節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意圖是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途酵母活化因子GAL4baitprey酵母雙雜交技術(shù)（THS、Y2Ｈ）概念：是一種用于篩選蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)，主要通過(guò)將被研究的蛋白質(zhì)融合到一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白的兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域之間(結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激活結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行操作。

b.1989年，由Song和Field建立關(guān)于轉(zhuǎn)錄激活因子

酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)獵物蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，如果檢測(cè)到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說(shuō)明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒(méi)有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究原理prey酵母活化因子GAL4BD基因AD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域TF蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域（二聚化結(jié)構(gòu)域）谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用

(1）、檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相互作用。

(2）、研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。(3)用已知功能的蛋白基因（誘餌蛋白）篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能。電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，且已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定A）DNAtobeanalyzed

復(fù)習(xí)題1、PCR的基本原理？PCR反應(yīng)體系包括哪些組分?常用PCR有哪些及其應(yīng)用。2、DNA測(cè)序需用哪些酶與底物？簡(jiǎn)述DNA測(cè)序的原理。3、簡(jiǎn)述酵母雙雜交原理？釣餌蛋白和獵物蛋白的作用及如何證明蛋白質(zhì)之間發(fā)揮了相互作用。4、比較轉(zhuǎn)基因，動(dòng)物克隆和基因敲除的概念。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)——目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)受精卵或著床前的胚胎干細(xì)胞活體組織檢查核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物的一個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)“多利”的誕生1997年2月27日英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林(Roslin)研究所的伊恩·維爾莫特科學(xué)研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊“多利”(Dolly)誕生，這一消息立刻轟動(dòng)了全世界。世界上第個(gè)克隆羊—多利中國(guó)完成世界首例轉(zhuǎn)基因克隆兔實(shí)驗(yàn)(圖)

左為克隆兔，右為代孕兔。2007年12月14日09:20:43來(lái)源：科技日?qǐng)?bào)中國(guó)首例異種克隆動(dòng)物“北山羊”在新疆降生2004美國(guó)科學(xué)家成功克隆靈長(zhǎng)類動(dòng)物韓國(guó)培養(yǎng)出世界上首批克隆狗（一）、基本概念基因剔除技術(shù)(geneknockout)

也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)將滅活的基因放入胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES)中，使這一滅活基因通過(guò)同源重組取代原有的目的基因，篩選到基因已定點(diǎn)滅活的細(xì)胞后，通過(guò)顯微注射將細(xì)胞注入小鼠囊胚中。細(xì)胞在小鼠囊胚中參與胚胎的發(fā)育，最終形成嵌合體小鼠。操作方式A、制備基因敲除的胚胎干細(xì)胞（同源重組）B、制備基因敲除動(dòng)物（小鼠）（二）、基因敲除的原理與程序A、制備基因敲除的胚胎干細(xì)胞

1、打靶載體的構(gòu)建：在一克隆載體上組裝包括，待敲除的目的基因（同源臂），用于篩選的新霉素（Neor）基因和胸苷酸激酶基因(tk)

。2、將構(gòu)建的打靶載體轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞，(為使靶載體上的新霉素基因能與干細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)基因發(fā)生同源重組而剔除目標(biāo)基因)。3、篩選基因敲除的胚胎干細(xì)胞待剔除基因克隆克隆載體重組載體切割基因使待剔除基因失去活性陽(yáng)性標(biāo)記基因Neor連接HSV-tk打靶載體褐色大鼠胚胎干細(xì)胞A、制備基因敲除的胚胎干細(xì)胞這樣打靶載體包含了：1、部分待剔除的基因片段，（用于與野生型的該基因進(jìn)行交換重組）2、陽(yáng)性篩選標(biāo)志基因（Neor，neomycin-resistancegene)、使細(xì)胞具有抵抗G418（能被新霉素抵抗基因的表達(dá)產(chǎn)物分解）的能力。3、陰性篩選標(biāo)志基因即胸苷酸激酶(thymidinekinase-tk)基因，來(lái)自單純庖疹病毒（HSV），當(dāng)它在受體細(xì)胞內(nèi)合成出tk時(shí)，可以分解細(xì)胞培養(yǎng)液中加入更昔洛韋，即gangcyclovir（一種環(huán)鳥(niǎo)苷酸底物)而產(chǎn)生有毒的分解物使細(xì)胞死亡，為陰性篩選標(biāo)志。

在特定基因剔除時(shí)，利用打靶載體上留下的部分待剔除的基因片段作為基因組上相同基因的同源臂，當(dāng)打靶載體與細(xì)胞基因組的同源基因發(fā)生同源重組時(shí)（聯(lián)會(huì)），打靶載體上的失活基因替代基因組上的基因，同時(shí)利用插入在基因同源臂之間的陽(yáng)性、陰性標(biāo)志基因進(jìn)行篩選鑒定。1231號(hào)發(fā)生位點(diǎn)同源重組，在G418培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；2號(hào)為隨機(jī)插入重組，帶入tk基因，可在G418培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但在gangcyclovir培養(yǎng)基中被殺死；3號(hào)未發(fā)生任何重組，為正常細(xì)胞，在G418培養(yǎng)基中被殺死。抵抗G418的基因tk基因B、制備基因敲除動(dòng)物（小鼠）1、將發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入來(lái)自黑色的小鼠胚泡中（形成嵌合體胚胎，兩套基因物質(zhì)）2、將胚泡植入假孕小鼠子宮中發(fā)育。3、誕生出雜合的嵌合體小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干細(xì)胞來(lái)自褐色小鼠，正常胚胎來(lái)自黑色小鼠。4、嵌合體小鼠與野生黑色小鼠交配，產(chǎn)生純黑色與純褐色的后代小鼠，其純褐色小鼠為雜合子，有一目的基因已被敲除。5、近親交配，產(chǎn)生純合子基因敲除小鼠（第四代）。打靶載體內(nèi)切酶消化線性化打靶載體轉(zhuǎn)染基因組同源重組同源重組的胚胎干細(xì)胞胚泡植入假孕小鼠雜合子小鼠正常小鼠雜合子小鼠交配雜合子小鼠兄妹交配純合子小鼠（基因剔除）黑色雌性大鼠來(lái)自褐色大鼠B、制備基因敲除動(dòng)物（小鼠）1、Neor

（neomycin-resistancegene)基因：陽(yáng)性篩選標(biāo)志，使細(xì)胞具有抵抗新霉素（G418）能力。2、胸苷酸激酶(thymidinekinase)的作用：陰性篩選標(biāo)志，分解底物為gangcyclovir殺死細(xì)胞（自殺基因）新霉素抗性基因(neo)是真核表達(dá)載體的常用篩選標(biāo)志,neo基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ),能催化G418、卡那霉素等多種氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性建立動(dòng)物模型目前已建立的動(dòng)物模型如?-地中海貧血，高脂蛋白血癥，阿爾茨海默氏病等。四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用基因診斷和基因治療第九節(jié)GeneDiagnosisandGeneTherapy（一）、定義直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。一、基因診斷(GeneDiagnosis)（二）、特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)；特異性強(qiáng)；靈敏度高；適應(yīng)性強(qiáng)DNA序列分析PCR技術(shù)（測(cè)序，限制酶酶切圖譜）3、基因芯片(genechip)4、分子雜交（三）、基因診斷常用技術(shù)方法(四)、基因診斷的應(yīng)用1、遺傳疾病2、感染性疾病，傳染性流行病3、腫瘤4、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，親子鑒定等5、器官移植組織配型例：1、遺傳性疾病如診斷地中海貧血，血友病，苯丙酮尿癥，產(chǎn)前診斷等2、傳染病如診斷HIV,SARS,乙肝病毒等，病原微生物3、對(duì)腫瘤的早期診斷：檢測(cè)p53基因突變，17號(hào)染色體，據(jù)悉，人類惡性腫瘤50~60%與該基因突變有關(guān)，美國(guó)Affymeri公司已把p53基因核心區(qū)（結(jié)合結(jié)構(gòu)域),酸性區(qū)（轉(zhuǎn)錄活化），堿性區(qū)（轉(zhuǎn)化區(qū)）中的已知突變序列制作成了探針，集成在基因芯片上用以檢測(cè)所有p53編碼區(qū)的錯(cuò)義突變，及單堿基缺失，插入等，預(yù)測(cè)癌癥的發(fā)生，早期診斷，主要檢測(cè)5~8外顯子，現(xiàn)已有檢測(cè)肺癌的芯片