om基因家族基因克隆及原核表達質(zhì)粒的構建

om基因家族基因克隆及原核表達質(zhì)粒的構建

桉樹是世界上最重要的紙漿和造紙材料。它已有100多年的歷史。它是中國南方和亞熱帶最重要的快速人工造林樹種，在中國造紙行業(yè)中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來,桉樹木材又被開發(fā)成生物柴油,使得桉樹有成為新型生物質(zhì)能源樹種的巨大潛力。木質(zhì)素是一種具有三維立體結構的天然高分子聚合物,廣泛存在于高等植物的維管束中,是木質(zhì)部細胞壁的主要成分之一。在木材細胞壁中,木質(zhì)素作為一種填充和粘合物質(zhì),以物理或化學的方式與纖維素和半纖維素相互之間緊密粘合在一起,而在制漿造紙工業(yè)中,需要將木質(zhì)素從纖維素和半纖維素中去除,從而產(chǎn)生大量的造紙廢液,嚴重污染環(huán)境。因此,去除木質(zhì)素已成為制漿造紙工業(yè)污染的主要源頭物質(zhì)。木質(zhì)素含量降低除了能夠減少造紙工業(yè)藥品和能量的消耗,也能明顯提高紙張的白度和顏色穩(wěn)定性。不同類型植物的木質(zhì)素單體組成明顯不同,裸子植物主要為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G木質(zhì)素),雙子葉植物主要含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素(G-S木質(zhì)素),單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯基木質(zhì)素(G-S-H木質(zhì)素)。木質(zhì)素三種單體的比例對造紙過程中木質(zhì)素去除難易程度和飼料中可消化性都具有重要影響。氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族(O-Methyltransferase,OMT)通常作用于植物體內(nèi)木質(zhì)素生物合成、類黃酮生物合成、生物堿生物合成等次生代謝途徑中一些小分子的甲基化,而這種甲基化則決定了這些小分子在植物體內(nèi)生理功能的特異性。COMT(咖啡酰O-甲基轉(zhuǎn)移酶)和CCoAOMT(咖啡酯乙酰輔酶A氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶)是OMT基因家族中控制植物次生細胞壁中的木質(zhì)素含量和組分的關鍵基因,對木材結構和強度等特性有密切關系,能夠控制木質(zhì)素G、S、H三種單體的比例和含量,是決定木質(zhì)素單體組分比例和木質(zhì)素去除難易程度的關鍵基因。通過在大腸桿菌等原核生物中表達目標基因的核苷酸序列片段,翻譯合成異源目的蛋白,可以方便快捷地研究目標蛋白的功能特征和酶學特性。本研究通過融合(硫氧化還原蛋白A,trxA)原核表達方式,對赤桉COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2三個基因進行高效表達與純化,為進一步研究這三個蛋白的功能和酶學活性提供基礎。1材料和方法1.1pcr擴增對基因cds擴增根據(jù)已克隆的赤桉COMT基因(GU109375)、CCoAOMT1基因(GQ889423)、CCoAOMT2基因(GQ889422),設計帶有酶切位點的PCR擴增引物,擴增目的基因的CDS(codingsequence)序列。在COMT基因擴增正向引物和反向引物分別引入EcoRI和HindⅢ酶切位點,CCoAOMT1和CCoAOMT2基因擴增正、反引物則分別引入EcoRI和XhoI酶切位點,用于插入至pET-32a原核表達載體中(表1,其中下劃線表示酶切位點)。1.2ob定位酶的pcr檢測用含有目的基因全長cDNA片段的三個質(zhì)粒DNA為模板,進行目的基因CDS序列的PCR擴增。使用PCR引物(表1)和TakaraPyrobest酶進行擴增,PCR程序為:預變性(94℃/5min);變性(94℃/40s)、退火(45s)、延伸(72℃/120s),35個溫度循環(huán);總延伸(72℃/8min)。COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2的退火溫度分別為60℃、62℃、58℃。純化回收目的產(chǎn)物,雙酶切后,與經(jīng)相同雙酶切的載體pET-32a進行體外連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,構建出最終的原核表達質(zhì)粒。1.3itpg誘導培養(yǎng)法將三個表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株BL21(λDE3),接入5mL含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.4,再按1∶100比例稀釋接種至新鮮的50mLLB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600達0.6,加入100mmol的IPTG貯藏液至終濃度為0.4mmol,進行誘導培養(yǎng)。在加入ITPG后的2h、3h和4h,分別取5mL菌液離心收集菌體。用500μL的PBS緩沖液重懸菌體進行超聲波破碎,離心分離出的上清液即為菌體的可溶性蛋白質(zhì)。1.4菌株的制備和純化(1)原核表達體系的放大培養(yǎng)。按照已優(yōu)化的原核表達體系,放大成500mL的培養(yǎng)體系,用于提取并純化目的蛋白。為獲得良好的通氣,培養(yǎng)基體積不超過搖瓶容量的20%。(2)滲透休克法提純目的蛋白。將搖瓶置于冰上5分鐘,于5000g條件下4℃離心5min收集菌體。再用適量預冷(約100mL)的高滲透壓溶液(80%蔗糖,2.5mmolEDTA,20mmolTrisHCl(pH8.0))重懸菌體,使菌體濃度達到OD550值等于5單位/mL,冰浴靜置10min;于15000g條件下離心30秒,去除上清后再重懸于同體積的低滲透壓溶液(2.5mmolEDTA,20mmolTrisHCl(pH8.0)),冰浴靜置10min;于15000g條件下4℃離心10min,收集含有目的蛋白的上清液。(3)從細胞質(zhì)中提純可溶性蛋白。將搖瓶置于冰上5min,于5000g條件下4℃離心5min收集菌體,重懸于100mLPBS緩沖液中。使用超聲波破碎儀在冰上破碎細胞,與14000g條件下4℃離心10min,收集含有可溶性重組蛋白的上清液。2結果與分析2.1赤桉comt原核原核的融合表達赤桉COMT通過EcoRI/HindⅢ雙酶切,CCoAOMT1、CCoAOMT2通過EcoRI/XhoI雙酶切,分別將三個目的基因的CDS插入至pET-32a的多克隆位點中,實現(xiàn)與trxA基因的融合表達。pET32a-COMT原核表達質(zhì)粒的EcoRI/HindⅢ雙酶切結果顯示,有兩條長度分別為1098bp和5900bp的條帶,長度較小的條帶與赤桉COMT的CDS序列大小一致;pET32a-CCoAOMT1、pET32a-CCoAOMT2原核表達質(zhì)粒的EcoRI/XhoI雙酶切結果與預期一致,分別酶切產(chǎn)生5900bp的載體片段,696bp的CCoAOMT1的CDS片段,和741bp的CCoAOMT2的CDS片段,表明三個目的基因CDS插入片段大小正確(圖1)。將構建的表達質(zhì)粒進行DNA雙向測序,表明所獲得的三個目的基因原核表達質(zhì)粒序列未發(fā)生變化。2.2原核表達體系采用SDS電泳方法,分析原核表達菌株在加入IPTG后不同誘導時間條件下的可溶性重組蛋白表達變化情況,分別優(yōu)化這個三個原核表達體系。結果顯示(圖2),赤桉COMT蛋白與TrxA標簽蛋白融合形成58.49kDa的融合蛋白,產(chǎn)物符合預期大小,在加入IPTG誘導表達4h后的可溶性COMT蛋白表達量最大;CCoAOMT1、CCoAOMT2的融合蛋白大小分別為44.57kDa、46.34kDa,分別在加入IPTG誘導表達2h后、3h后的可溶性蛋白表達量最大。2.3重組融合蛋白tci-sds-東南角表達本文使用LaVallie報道的滲透休克提取法,在4℃溫度下將大腸桿菌先后懸浮于高滲透壓與低滲透壓的溶液中,利用滲透震蕩作用(osmoticshock)可將細胞質(zhì)中的可溶性TrxA-目的蛋白的重組融合蛋白釋放細胞外,用于提純目的蛋白。Tricine-SDS分析結構表明,對表達的赤桉COMT重組融合蛋白使用滲透休克作用后,只有少量的融合蛋白被釋放到滲透休克組分中,絕大部分保留在細胞質(zhì)可溶部分中,還有一部分融合蛋白以不溶解的包涵體形式存在于細胞質(zhì)中;而赤桉CCoAOMT1和CCoAOMT2的重組融合蛋白則主要存在于滲透休克組分中(圖3)。因此,赤桉COMT重組融合蛋白可在加入ITPG誘導4h后直接從細胞質(zhì)的可溶部分中提取,而赤桉CCoAOMT1和CCoAOMT2的重組融合蛋白可在加入ITPG誘導2h后通過滲透休克作用進行提取。3基因家族在植物體內(nèi)的表達水平分析不同物種的OMT基因家族成員差別較大,涉及到多個此生代謝物質(zhì)合成途徑。OMT基因家族所屬的甲基化酶超基因家族(包含OMT、SMT(S-methyltransferase)等多個基因家族)則更加復雜龐大,通過序列相似性法則歸類各個成員之間的關系時,易發(fā)生與酶學特性的不一致,如通過序列比較認為是長春花OMT的一個基因,酶學實驗則表明是SMT基因家族成員。隨著更多蛋白質(zhì)的三維結構被測定,有利于從高級結構水平上理解蛋白質(zhì)結構與其功能的關系。通過蛋白質(zhì)結構模擬技術,可在三維結構水平上進行OMT家族成員的分類。在植物木質(zhì)素合成途徑中,OMT基因家族主要成員為COMT和CCoAOMT,作用于木質(zhì)素合成途徑中的底物包括:5-HydroxyConiferaldehyde(5-羥基松柏醛)、5-HydroxyconiferylAlcohol(5-羥基松柏醇)和CaffeoylCoenzymeA(咖啡酯乙酰輔酶A)等。本研究所克隆的赤桉CCoAOMT為2個成員的小型亞基因家族。通過在大腸桿菌等原核生物中表達目的基因的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物,是研究目標蛋白的功能特征和酶學特性的基礎。本研究通過構建基于pET-32a的CCoAOMT1、CCoAOMT2、COMT的原核重組表達質(zhì)粒,并實現(xiàn)了該三個重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達。通過分析大腸桿菌誘導表達蛋