高效液相色譜法的新進(jìn)展

高效液相色譜法的新進(jìn)展

周敏

第一節(jié)高效液相色譜的定義定義

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在色譜柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。第二節(jié)儀器裝置

所使用的儀器為高效液相色譜儀，基本是由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)采集及處理等幾部分構(gòu)成。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。高壓輸液系統(tǒng)

高效液相色譜輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置等。貯液罐及流動(dòng)相

貯液罐貯液罐是一個(gè)存放流動(dòng)相（洗脫液）的容器,所以其結(jié)構(gòu)材料必須對流動(dòng)相是化學(xué)惰性的。常用的材料為玻璃、不銹鋼或表面噴涂聚四氟乙烯的不銹鋼等。容積一般為0.5～2升。

流動(dòng)相流動(dòng)相的配制應(yīng)首選色譜純試劑，水應(yīng)用純化水。流動(dòng)相使用前應(yīng)先用0.45μm或更小孔徑微孔濾膜過濾，目的是除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。其次，流動(dòng)相進(jìn)入高壓泵前應(yīng)脫氣，目的是除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡，如果不去除氣泡，會(huì)有以下情況發(fā)生：（1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積；（2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形；（3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)。脫氣的方法有加熱法、加壓法、超聲去除法、惰性氣體置換法及在線脫氣法。

反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇—水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時(shí)首選乙腈—水系統(tǒng)）。乙腈與甲醇相比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）乙腈洗脫能力較強(qiáng)（40%乙腈約相當(dāng)于50%甲醇，相當(dāng)于30%四氫呋喃）；（2）乙腈具有良好的溶解能力，能使色譜峰的峰形更加對稱；（3）乙腈與水能夠較好的互溶，并且黏度較甲醇—水??；（4）乙腈的截止波長是有機(jī)溶劑中最低的，高純度乙腈截止波長為190nm。但同時(shí)具有以下缺點(diǎn)：（1）乙腈價(jià)格較甲醇昂貴；（2）在低pH條件下，磷酸鹽在乙腈溶液中溶解度較小，有研究表明，當(dāng)乙腈接近50%（體積分?jǐn)?shù)）且磷酸鹽緩沖鹽達(dá)0.050mmol/L時(shí)會(huì)生成沉淀，而且這種沉淀是逐步形成的；（3）乙腈不很穩(wěn)定，易與強(qiáng)酸反應(yīng)，如硫酸；（4）與醇類溶劑相比，乙腈毒性較大，但在正常操作下，基本是安全的。

如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其它溶劑系統(tǒng)。如在上述二元流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃，能夠改善某些難分離的物質(zhì)的分離度，還可加入少量有機(jī)堿類（如三乙胺等）可改善色譜峰峰拖尾現(xiàn)象。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。另外，由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。高壓輸液泵

高壓輸液泵是高效液相色譜儀中的關(guān)鍵部件之一。它將洗脫液在高壓下連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。在高效液相色譜儀中,對高壓輸液泵的性能有如下要求：

1.流量穩(wěn)定。為使色譜過程具有良好的重現(xiàn)性,泵的輸出流量要恒定。其流量精度為1%左右。

2.輸出壓力高。由于色譜柱填料顆粒細(xì),為使洗脫液以一定的流速流過色譜柱,泵必具有一定輸出壓力。不同的儀器，所使用的輸出壓力單位不同，最高的輸出壓力為500kg/cm2。另外,輸出壓力應(yīng)平衡,脈動(dòng)小,有利于降低檢檢測器的噪音,提高信噪比和柱效。3.流量范圍寬。流量可調(diào)范圍大,一般在0.01～10ml/min范圍內(nèi)任選。

4.耐酸、堿緩沖液腐蝕。

5.泵體易于清洗。具有梯度洗脫功能，操作方便，容易維修。

目前在高效液相色譜儀中所采用的高壓輸液泵,按排液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵;按工作方式又可分為液壓隔膜泵、氣動(dòng)放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵四種。前兩種為恒壓泵,后兩種為恒流泵。目前在高效液相色譜儀上采用最廣泛的為往復(fù)柱塞泵。

由驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)(馬達(dá)、減速器、驅(qū)動(dòng)凸輪)帶動(dòng)的小柱塞(φ3～4mm),在以密封環(huán)密封的液缸內(nèi)，以每分鐘數(shù)十次至一百多次的頻率作往復(fù)運(yùn)動(dòng)。當(dāng)小柱塞自液缸內(nèi)抽出時(shí),出口單向閥由于管路中液體的外壓力迫使它關(guān)死,液體自入口單向閥吸入液缸;當(dāng)小柱塞被推入時(shí),入口單向閥關(guān)死,液體經(jīng)壓縮自出口單向閥排出,如此周而復(fù)始,壓力逐漸上升。泵的輸出流量,可借柱塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)的沖程或馬達(dá)的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)。由于泵的柱塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)的頻率較高,所以對密封環(huán)的耐磨性及單向閥的剛度和精度要求很高。密封環(huán)一般采用聚四氟乙烯加添加劑材料制造,而單向閥的球、閥座及柱塞桿則用人造紅寶石材料。

往復(fù)柱塞泵因?yàn)樗囊焊兹莘e小,易于清洗和更換溶劑系統(tǒng),因此特別適合于梯度淋洗,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于高效液相色譜中。但由于泵體本身的結(jié)構(gòu),決定了它的輸出壓力是隨柱塞運(yùn)動(dòng)位置的變化而變化的,因此輸出壓力有明顯的起伏脈動(dòng)。為了克服此缺點(diǎn),目前儀器中使用的泵,大致用以下幾種方法減少它的壓力脈動(dòng)。①采用多頭泵(二頭或二頭以上)交替聯(lián)動(dòng)②壓力脈動(dòng)阻滯器③改進(jìn)驅(qū)動(dòng)凸輪的幾何形狀梯度洗脫裝置

梯度洗脫,又稱溶劑程序。在色譜分離過程中,洗脫液的組成按一定的速率連續(xù)改變,其作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫。由于液相色譜中洗脫液的極性變化直接影響樣品組分的保留值(或k’值),因此梯度洗脫可改善復(fù)雜樣品的分離度,縮短分析周期,改善峰形和提高樣品的最小檢測量。一般在液相色譜中,梯度洗脫比程序升溫、流速程序、重復(fù)分離和聯(lián)用柱等幾種方法有效得多。梯度洗脫裝置可分為以下兩類:1.低壓梯度洗脫裝置低壓梯度又稱外梯度。它是一種在常壓下洗脫液按預(yù)先規(guī)定的比例混合后,再由高壓泵輸入色譜柱,所以也稱為泵前混合。最簡單的低壓梯度裝置。是利用兩個(gè)直角三角形容器,其幾何位置不同,兩種洗脫液的混合比例曲線也不同。由于其重復(fù)性差,現(xiàn)已很少采用。電磁比例閥的開關(guān)頻率,由控制器控制。改變控制器程序,即可得到任意混合濃度的曲線。2.高壓梯度洗脫裝置高壓梯度又稱內(nèi)梯度。它是將溶劑經(jīng)高壓泵加壓后再混合的梯度洗脫裝置。常見的一種是由兩臺(tái)高壓泵、梯度程序控制器、混合器等部件組成。兩臺(tái)泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器,經(jīng)充分混合后進(jìn)入色譜柱。這是一種泵后高壓混合形式。高壓梯度所采用的泵,多為往復(fù)柱塞泵或螺旋泵。由此所獲得的流量精度高,梯度洗脫曲線重復(fù)性好。梯度洗脫的溶劑混合器應(yīng)具備容積小、無死區(qū)、清洗方便、混合效率高等性能，才能獲得重復(fù)的、滯后時(shí)間短的梯度洗脫曲線。3.注意事項(xiàng)（1）溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差；（2）梯度混合的溶劑互溶性要好；（3）梯度洗脫應(yīng)使用對流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）。進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)是將被分析試樣導(dǎo)入色譜柱的裝置。對于液相色譜的進(jìn)樣裝置，要求重復(fù)性好，死體積小，保證中心進(jìn)樣,進(jìn)樣時(shí)對色譜柱系統(tǒng)流量波動(dòng)要小，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。進(jìn)樣系統(tǒng)包括取樣、進(jìn)樣兩個(gè)功能,而實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)功能又分手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式。柱溫箱

柱溫箱為放置色譜柱的地方，一般可以存放1～3根色譜柱。應(yīng)用柱溫箱可以保持色譜柱溫度，不受外界環(huán)境影響，主要表現(xiàn)為分析結(jié)果重現(xiàn)性好、提高柱效、降低柱壓、保證檢測穩(wěn)定性。較為先進(jìn)的柱溫箱不但可以保持較高溫度（80～100℃），也可以保持較低溫度（低于室溫10℃），同時(shí)可設(shè)置溫度程序控制。色譜柱

色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件，要求分離度高、柱容量大、分析速度快。要達(dá)到如此好的性能，不僅與固定相本身的性能有關(guān)，而且與色譜柱結(jié)構(gòu)、裝填和使用技術(shù)等有關(guān)。色譜柱的使用及保養(yǎng)1.使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。

2.以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱使用溫度，但不宜超過60℃。檢測器

高效液相色譜法具有高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)。微量組分經(jīng)色譜柱分離后的檢測既不能用人的肉眼也不能分段取樣后用儀器檢測，只能采用檢測器在色譜柱后直接檢測。樣品組分洗脫液中的濃度或物理量變化，由檢測器連續(xù)地轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，在記錄儀上迅速地給出直觀的信息。操作者可按照所描繪的色譜峰位置來定量地判斷分離情況的優(yōu)劣,并根據(jù)峰面積定量地測定各組分的含量。

最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。餾分收集器

如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做了其他波譜鑒定,或獲得少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的。用小試管收集、手工操作，只適合于少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。餾分收集器比較理想，因?yàn)楸阌谟梦⑻幚頇C(jī)控制，按預(yù)先規(guī)定好的程序，或按時(shí)間，或按色譜峰的起落信號(hào)逐一收集和重復(fù)多次收集。數(shù)據(jù)采集及處理

把檢測器的信號(hào)轉(zhuǎn)換為色譜圖，一般采用色譜積分儀及色譜工作站進(jìn)行。積分儀較為簡單，可以設(shè)定積分參數(shù)，記錄保留時(shí)間、峰號(hào)以及峰面積，但是分離度和理論板數(shù)需手工計(jì)算，偏差較大；積分儀可儲(chǔ)存少量色譜圖，但關(guān)機(jī)后儲(chǔ)存的色譜圖即不再保存；積分儀記錄介質(zhì)多為熱敏紙，保存時(shí)間較長后顏色消退，需另行復(fù)印后保存。

目前大部分高效液相色譜儀數(shù)據(jù)采集多用色譜工作站。較為簡單的色譜工作站一般為國內(nèi)開發(fā)，價(jià)格較為便宜，但只能進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，色譜條件只能由儀器設(shè)定。相對于積分儀來說，由于使用計(jì)算機(jī)控制，色譜圖比較一目了然，改變積分參數(shù)后，可清晰看出色譜圖的變化；可以進(jìn)行分離度、理論板數(shù)等簡單計(jì)算。第三節(jié)檢測方法紫外檢測法

紫外檢測法是高效液相色譜中最常用的檢測方法。由于有機(jī)化合物中近百分之八十都具有紫外吸收，因此紫外檢測器的應(yīng)用最早也最廣。這種檢測器具有很高的靈敏度，對環(huán)境溫度及流速波動(dòng)不甚敏感，適用于梯度洗脫操作。但是紫外檢測器一次只能得到一個(gè)波長的色譜圖，而二極管陣列檢測器可以采集三維圖譜，針對每一個(gè)色譜峰可以進(jìn)行光譜掃描，進(jìn)行峰純度測定。電化學(xué)檢測法

高效液相色譜中的電化學(xué)檢測法，是利用電化學(xué)固有的靈敏度對洗脫液中痕量電活性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，既具有寬的線性動(dòng)力學(xué)測定范圍(106)及高的靈敏度(10-12g)，可與熒光檢測法相比，又可用于色譜行為相似而電化學(xué)性質(zhì)不同的化合物的測定，更具有專屬性。因此，在藥物分析中，高效液相色譜電化學(xué)檢測法，主要應(yīng)用于復(fù)雜樣品中痕量組分的選擇測定，以及較復(fù)雜生物樣品中藥物及其代謝物的測定。第五節(jié)色譜儀常見故障的分析和排除方法

在高效液相色譜的應(yīng)用中，故障主要出現(xiàn)在壓力異常、漏液、保留時(shí)間漂移、基線漂移及噪聲、峰形異常等幾個(gè)方面。故障的起因是多方面的，在儀器的每一環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)化學(xué)或者機(jī)械上的問題。而準(zhǔn)確地分析故障的原因所在和及時(shí)地排除故障，除專業(yè)維修人員外，對實(shí)驗(yàn)者來說也是應(yīng)當(dāng)了解的。下面就以上五個(gè)方面的故障進(jìn)行分析，簡單的故障可自己動(dòng)手排除。壓力異常

（一）無壓