電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

生檢室：姚世霞

引言 電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。1937年，瑞典生化學(xué)家Tiselius發(fā)明了Tiselius電泳儀，在此基礎(chǔ)上建立了研究蛋白質(zhì)的自由界面電泳方法，利用該法首次證明人血清是由白蛋白、α、β、γ球蛋白組成，并因此于1948年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。隨后電泳技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn),特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類(lèi)型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。一.電泳的概念二.電泳技術(shù)基本原理三.電泳技術(shù)分類(lèi)四.幾種常見(jiàn)電泳方法的比較五.電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用一.電泳的概念電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程。電泳技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好+-二.電泳技術(shù)基本原理1.原理：

不同的帶電顆粒在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度，主要與其所帶凈電荷量，分子量及分子形狀有關(guān)。

pH>pI分子帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng);

pH<pI分子帶正電荷,在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng);

泳動(dòng)速度u=v=d/t=dleV/lVt

電泳的基本原理

在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類(lèi)和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。2.影響電泳速度的因素2.1電場(chǎng)強(qiáng)度泳動(dòng)速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。常壓電泳(100—500V).2—10V/cm，幾小時(shí)或幾天；蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì);高壓電泳(500—1000V).20—200V/cm，幾分鐘；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì).2.2溶液的pH值pH距待分離物質(zhì)的pI越遠(yuǎn)，泳動(dòng)速度越大2.3溶液離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越小,電動(dòng)勢(shì)越大,泳動(dòng)速度越快。2.4電滲現(xiàn)象：在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。三.電泳技術(shù)分類(lèi)原則上按電泳的原理來(lái)分，可分為二類(lèi)：自由界面電泳：又稱(chēng)移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類(lèi)型。電泳技術(shù)分類(lèi)四.幾種常見(jiàn)電泳的比較類(lèi)型優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)紙電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單分辨率差，電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單，樣品用量少分辨率差瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無(wú)電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離五.電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

藥典中的收載情況英國(guó)藥典：

1975年版開(kāi)始將電泳收載入附錄,1980版、1993版將電泳方法增加到6種,1998年版又對(duì)自由移動(dòng)界面電泳作了詳細(xì)說(shuō)明美國(guó)藥典：

1985版起開(kāi)始將電泳收載入附錄,并對(duì)凝膠電泳的原理、影響因素作了詳細(xì)的說(shuō)明,NF22冊(cè)又增加了DESK電泳。中國(guó)藥典：

1990年版二部首次收載入附錄中，1995年版、2000年版、2005年版將電泳中的五種電泳技術(shù)(紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法,聚丙烯酰胺凝膠電泳法、SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法在附錄中規(guī)定下來(lái),并對(duì)高效毛細(xì)管電泳也作了詳細(xì)的說(shuō)明。1.紙電泳法(paperelectrophoresis)紙電泳法：是用濾紙作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單,應(yīng)用廣泛；電泳時(shí)間長(zhǎng),分辨率較差。應(yīng)用：三磷酸腺苷二鈉原料、三磷酸腺苷二鈉注射液的含量的測(cè)定；胞磷膽堿鈉有關(guān)物質(zhì)檢查。此外，在植物化學(xué)成份的分離中得以應(yīng)用,如糖類(lèi),三萜類(lèi)等可利用其衍生物的方法使其分子帶電荷,再用紙電泳法進(jìn)行分離。2醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳：是用醋酸纖維素薄膜作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。特點(diǎn)：電泳后區(qū)帶界限清晰,分辨力強(qiáng)；通電時(shí)間較短；對(duì)各種蛋白質(zhì)都幾乎完全不吸附，無(wú)拖尾現(xiàn)象；對(duì)染料也不吸附；電滲作用雖高但很均一,不影響樣品的分離效果,必須在密閉的容器中進(jìn)行電泳,并使用較低壓電流避免蒸發(fā)。

應(yīng)用：《中國(guó)藥典2005版三部》中人血白蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、2000版中人胎盤(pán)蛋白、人胎盤(pán)血免疫球蛋白中的蛋白質(zhì)純度測(cè)定。臨床檢驗(yàn)中已經(jīng)廣泛用于血清蛋白,血紅蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,類(lèi)固醇及同工酶、尿蛋白等的分離分析以及免疫電泳等中，用于疾病的診斷。3聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳:

根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀的不同，在電場(chǎng)的作用下，產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度而分離的方法。特點(diǎn)：具有電泳和分子篩的雙重作用。重復(fù)性高,凝膠柱彈性好,無(wú)電滲作用,且設(shè)備簡(jiǎn)單,樣品量少,分辨率高。應(yīng)用：《中國(guó)藥典2005年版二部》中胰島素及中性胰島素注射液的有關(guān)蛋白質(zhì)檢查

此外，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳還用于性別基因鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳法目前還廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的研究以及臨床化驗(yàn)。4.瓊脂糖電泳

瓊脂糖電泳：是用瓊脂糖作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。

應(yīng)用：判斷擴(kuò)增片斷的大?。换厥諗U(kuò)增片斷，用于轉(zhuǎn)印進(jìn)行Southern印跡用于中藥材的鑒別真?zhèn)?、分辨?yōu)劣，中藥材指紋圖譜的研究等。

5.免疫電泳免疫電泳：把電泳技術(shù)與免疫擴(kuò)散結(jié)合起來(lái)，基于抗原的電泳遷移以及與抗體的專(zhuān)一性免疫沉淀反應(yīng)。在大部分電泳中，樣品中的抗原通過(guò)含有相應(yīng)抗體的pH8.6的薄層瓊脂糖凝膠，抗原在pH8.6時(shí)通常帶強(qiáng)負(fù)電，而抗體在此pH不帶電，不能遷移動(dòng)?？乖诤锌贵w的凝膠中電泳時(shí)發(fā)生免疫反應(yīng)。最初，抗原過(guò)量，所以?xún)H產(chǎn)生可溶性的免疫混合物，與抗原一起向陽(yáng)極移動(dòng)，當(dāng)抗體與抗原比例合適時(shí)就形成大的、不溶性的免疫沉淀。應(yīng)用：中國(guó)藥典三部中：人血白蛋白及各類(lèi)免疫球蛋白的鑒別實(shí)驗(yàn)，均采用本方法。 可用于檢查蛋白質(zhì)制劑的純度，研究抗血清制劑中是否具有抗某種已知抗原的抗體，檢驗(yàn)兩種抗原是否相同等。

6高效毛細(xì)管電泳法

(highperformancecapiaryelectrophoresis,HPCE)高效毛細(xì)管電泳法:根據(jù)離子在緩沖液中遷移的速度與電場(chǎng)呈正比原理,將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體,是繼高效液相色譜法出現(xiàn)后分析科學(xué)領(lǐng)域的又一次革命。特點(diǎn)：“三高二少”，即具有高靈敏度、高效快速、高分辨率,用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn),可方便地連續(xù)洗脫樣品。HPCE的分類(lèi)

毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC,

HPCE

MECC)