熒光定量PCR基礎(chǔ)原理

○PCR擴(kuò)增的理論模式○RealtimePCR理論基礎(chǔ)PCR是將樣本中微量的DNA模版放大來研究模版特性。隨著研究的深入，要了解樣本中基因的表達(dá)模式與疾病的關(guān)系，就需要了解標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺期的時間和平臺期的高低都有很大變化，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也往往不同。因此經(jīng)過PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實(shí)情況。通過凝膠電泳EB染色或者同位素標(biāo)記只能定量PCR的終產(chǎn)物量，而不能定量起始DNA模版的拷貝數(shù)。實(shí)時熒光定量PCR實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高，特異性和可靠性強(qiáng)，重復(fù)性好，自動化程度高、無污染性等突出優(yōu)勢，因此被公認(rèn)為當(dāng)今世界用于臨床的最先進(jìn)核酸分子診斷技術(shù)。PCR擴(kuò)增的理論模式PCR中，隨著擴(kuò)增周期的增加，模板以指數(shù)方式進(jìn)行擴(kuò)增。PCR理論方程：N=N0×(1+E)nN:擴(kuò)增子數(shù)量N0:起始模板數(shù)量E：擴(kuò)增效率n:循環(huán)數(shù)此公式僅在指數(shù)擴(kuò)增期（20-30個循環(huán)）內(nèi)成立。PCR分期——“S”形曲線對PCR擴(kuò)增過程的詳細(xì)分析表明，PCR擴(kuò)增曲線可被分為三個典型時期：早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（或?qū)?shù)線形擴(kuò)增期），以及晚期的平臺期理論上PCR過程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增長的，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線；因?yàn)殡S著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，最終進(jìn)入平臺期。兩種定量方法兩種定量方法終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量無規(guī)律對數(shù)期分析：平行性好終點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：誤差大拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好，誤差小影響因素多擴(kuò)增效率恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小擴(kuò)增效率恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性普通PCR技術(shù)的檢測模式普通PCR儀器擴(kuò)增，約2.5小時瓊脂糖凝膠電泳，約1小時EB染色，約20分鐘紫外成像陰性陽性樣品檢測結(jié)果無法定量實(shí)時熒光定量PCR的檢測模式熒光定量PCR儀器擴(kuò)增，約2小時檢測過程有實(shí)時監(jiān)測數(shù)據(jù)光滑的S型指數(shù)曲線，陽性無S型指數(shù)曲線，陰性實(shí)時熒光定量PCR的檢測模式需絕對定量時四個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線系統(tǒng)即可自動計算出未知樣品的濃度陰性結(jié)果曲線圖示陽性結(jié)果曲線圖示實(shí)時熒光定量PCR基本原理在常規(guī)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，加入熒光染料或熒光標(biāo)記的探針，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物不段累積，熒光信號強(qiáng)度等比增強(qiáng)。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測，從而對起始模板定量及定性的分析。熒光擴(kuò)增曲線分三階段熒光背景信號，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，平臺期熒光背景信號階段：該時期擴(kuò)增的熒光信號被背景信號所掩蓋，擴(kuò)增產(chǎn)物量無法判斷。平臺期：擴(kuò)增產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量無線性關(guān)系，無法計算起始DNA拷貝數(shù)。熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段：該時期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系，因此選擇這一階段進(jìn)行定量分析。引入兩個概念：熒光閾值和Ct值。實(shí)時定量PCR的兩個重要概念（1）熒光域值（

threshold）：熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定一個值，以PCR反應(yīng)的前15

個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10

倍。閾值=基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差x10實(shí)時定量PCR的兩個重要概念(2)Ct值：也稱循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循環(huán)過程中熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。在實(shí)際操作中，Ct值也就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值的循環(huán)次數(shù),可見Ct值取決于閾值。

基線閾值Ct值Ct值∝DNA起始濃度Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，達(dá)到熒光閾值的Ct值越小。Rn=RB+X0(1+E)nRs總信號=本底信號+分子數(shù)量×單位信號強(qiáng)度Rn：第n個循環(huán)時的總信號RB：本底RS：單位信號強(qiáng)度X0：起始DNA數(shù)目E：PCR效率Rn=RB+X0(1+E)nRs當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（線性方程）定量方法利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。所以，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。RealtimePCR化學(xué)原理雙鏈DNA結(jié)合染料染色-非特異性檢測–SYBR?GreenI–溴乙錠(EthidiumBromide)探針標(biāo)記-特異性檢測–TaqManTM–TaqManMGB–Dual-oligoFRETpairs–分子信標(biāo)(Molecularbeacons)–ScorpionsTM/AmplifluorTMSYBR

Green

I熒光染料的作用原理SYBR

Green

I是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，可與所有的各種序列的雙鏈DNA分子結(jié)合。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；變性時，DNA雙鏈分開時，熒光信號急劇減弱。在延伸結(jié)束階段，采集熒光信號。因此，在一個體系內(nèi)，信號強(qiáng)度與DNA雙鏈總數(shù)目成正比其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。退火：產(chǎn)生熒光信號結(jié)合SYBRGreenISYBRGreenI染料僅在與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合時發(fā)射熒光，所發(fā)射的光波是藍(lán)色光。SYBRGreenI不會與單鏈DNA結(jié)合，因此變性時熒光強(qiáng)度最低。dsDNA形成單鏈（圖A）合成雙鏈（圖B）時，SYBRGreenI結(jié)合于dsDNA上，結(jié)合的SYBRGreenI（綠色光）的熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)。延伸末期（圖C）時，所有DNA均是雙鏈，結(jié)合狀態(tài)的SYBRGreenI含量達(dá)最大，該P(yáng)CR周期