第四章基因文庫的建立

第四章

基因文庫的建立

基因文庫(genelibrary)基因組文庫(genomiclibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

第一節(jié)基因組文庫的構(gòu)建

定義：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。一.基因組文庫的規(guī)模N—基因組文庫克隆總數(shù)P—所需機(jī)率N=f—插入片段與基因組DNA長度之比

二．建立基因組文庫的一般程序

1．載體DNA片段的制備

DNA分離純化限制酶切脫磷酸化反應(yīng)

2．供體DNA片段的制備總DNA分離純化機(jī)械剪切法分離特定大小DNA片段酶法部分酶切分離特定大小DNA片段完全酶切

ln（1-P）ln（1-f）用不同生物的完全基因組構(gòu)建的基因組文庫應(yīng)具有的克隆數(shù)和實際克隆數(shù)

3.供體與載體DNA連接

要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃度和兩種DNA分子的克分子比率。

4.重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴(kuò)增

利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴(kuò)增（重組子比率可能發(fā)生變化）

5.基因組文庫質(zhì)量的評價

1）文庫規(guī)模----隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒DNA，電泳測定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計算文庫大小。2）重組頻率----頻率越高，質(zhì)量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。

三.

利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。四.

利用λ載體構(gòu)建基因組文庫

1.載體DNA片段的制備方法:

左右臂DNA片段的獲得

2.供體DNA片段的制備:限制酶部分酶切，機(jī)械剪切法

3.重組DNA分子的形成：

控制克分子比率，使其形成串狀DNA分子

4.重組DNA分子的包裝

1）λDNA的包裝物的制備

使用的大腸桿菌菌株：E.coli

BHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包裝蛋白E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-頭部蛋白

i.

兩菌株分別培養(yǎng)，分別收集和制備，包裝前混合----本底低（對λDNA分子大小有嚴(yán)格限制），高效。ii.

兩菌株分別培養(yǎng)，混合收集和制備----操作簡單，本底高，可包裝不同大小的λDNA分子。2）重組λDNA分子的包裝過程包裝制備物（-70℃）于冰上緩慢融化加入重組λDNA分子邊融化邊混合邊包裝離心除去細(xì)胞碎片λ顆粒于-70℃保存待用5.基因組文庫的擴(kuò)增

包裝的λ顆粒感染E.coli培養(yǎng)分離λ顆粒-70℃保存五.

利用COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫

構(gòu)建過程與λ載體構(gòu)建過程相似:兩臂DNA片段的制備，供體DNA片段的制備，兩DNA的連接和重組DAN分子的包裝。單COS質(zhì)粒載體和雙COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫。為提高文庫質(zhì)量，可采取以下措施：

1.

雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體

2.供體DNA脫磷酸化以避免供體DNA間的連接導(dǎo)致重排

3.載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形發(fā)生載體DNAXhoIorSalI酶切補(bǔ)CT連接重組DNA供體DNASau3AI部分酶切補(bǔ)AG

4.采用文庫快速構(gòu)建法以避免擴(kuò)增文庫時DNA丟失利用單COS質(zhì)粒載體文庫利用雙COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫

七.利用YAC載體構(gòu)建基因組文庫

1.兩臂DNA片段的制備:

pYAC4BamHI/EcoRI脫磷酸化

2.供體DNA片段的制備:

瓊脂糖凝膠-DNA樣品的制備EcoRI部分酶切脈沖場凝膠電泳片段回收和純化

3.DNA的連接

4.重組DAN分子的轉(zhuǎn)化:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

5.轉(zhuǎn)化子的保存:單菌落保存于96孔平板中酵母人工染色體構(gòu)建建立基因組文庫的載體

A鳥槍法5目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進(jìn)鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略

隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離

鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：

片段長度不均一，粘性末端便于連接，但可能使基因斷開。部分酶切：

片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整

與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體;如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率

使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

鳥槍法操作的改進(jìn)例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA