基于微衛(wèi)星dna標(biāo)記的zzcla長(zhǎng)爪沙鼠群體遺傳多樣性分析

基于微衛(wèi)星dna標(biāo)記的zzcla長(zhǎng)爪沙鼠群體遺傳多樣性分析

長(zhǎng)爪沙鼠，也被稱(chēng)為沙田鼠，屬于母乳喂養(yǎng)、牙齒科、老鼠科和沙鼠科。它主要分布在我國(guó)的主要分布地區(qū)內(nèi)蒙古及周邊地區(qū)的牧場(chǎng)上。這是一個(gè)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用廣泛的“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于具有許多獨(dú)特的生物學(xué)特征,長(zhǎng)爪沙鼠已被廣泛用于醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。長(zhǎng)爪沙鼠的腦血管不同于其他動(dòng)物,有獨(dú)特的解剖特征,腦底動(dòng)脈環(huán)后交通枝缺損,沒(méi)有連系頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)和椎底動(dòng)脈系統(tǒng)的后交通動(dòng)脈,不能構(gòu)成完整的Willis動(dòng)脈環(huán),利用此特征,結(jié)扎沙鼠的單、雙側(cè)頸動(dòng)脈,很容易造成腦梗塞病變。長(zhǎng)爪沙鼠具有類(lèi)似人類(lèi)自發(fā)性癲癇發(fā)作的特點(diǎn),月齡不同,發(fā)作頻率也不同,尤其是生后2月齡左右的沙鼠,對(duì)非特異性因子具有感受性,有的可因癲癇發(fā)作致死。加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校Loskota等在沙鼠具有癲癇發(fā)作特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,育成新的品系,培育出發(fā)作感受型WJL/UC和發(fā)作抵抗型STR/UC兩個(gè)品系。長(zhǎng)爪沙鼠接種幽門(mén)螺桿菌(Hp)后可致慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌、MALT淋巴瘤,壽命較小鼠長(zhǎng),可以建立Hp長(zhǎng)期感染動(dòng)物模型,其胃黏膜發(fā)生的病理改變與人類(lèi)Hp感染發(fā)生的胃黏膜改變類(lèi)似。近期Ohkusa等還發(fā)現(xiàn)Hp感染可致蒙古沙鼠十二指腸炎和十二指腸淺表潰瘍。沙鼠是目前較為理想的Hp感染動(dòng)物模型。盡管長(zhǎng)爪沙鼠的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)和繁殖方法及生物學(xué)特性等已進(jìn)行了廣泛研究,但其遺傳背景的研究還不夠深入,分子標(biāo)記技術(shù)在這方面研究中具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。微衛(wèi)星DNA又稱(chēng)短串聯(lián)重復(fù)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列,其基本構(gòu)成單位為2～6bp,多位于編碼區(qū)附近,也可位于基因內(nèi)的間隔區(qū)、外顯子、內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)域,且分布均勻,是一類(lèi)用途十分廣泛的DNA分子標(biāo)記。用微衛(wèi)星作為長(zhǎng)爪沙鼠的遺傳標(biāo)記,采用PCR技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)爪沙鼠遺傳多態(tài)性,開(kāi)展長(zhǎng)爪沙鼠遺傳領(lǐng)域的研究,可以為長(zhǎng)爪沙鼠資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。Neumann等用克隆方法篩選了9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)并對(duì)歐美的野生及實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)爪沙鼠群體進(jìn)行了研究。趙太云等從長(zhǎng)爪沙鼠近緣物種大、小鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出8個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)。Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠是浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心馴養(yǎng)的嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群,已保種達(dá)40余代,為國(guó)內(nèi)維持時(shí)間最長(zhǎng)、特性穩(wěn)定、應(yīng)用單位最多、使用量最大以及基本生物學(xué)特性研究較系統(tǒng)的第一個(gè)遠(yuǎn)交封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠是研究EHFV特性和研制流行性出血熱疫苗的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。最近又用Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠研制出雙價(jià)苗,供應(yīng)社會(huì);衛(wèi)生部上海生物制品研究所生產(chǎn)出血熱疫苗所用長(zhǎng)爪沙鼠原種亦來(lái)源于Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠封閉群。但是隨著遺傳代數(shù)的增加,導(dǎo)致基因雜合度減小,出現(xiàn)基因丟失等現(xiàn)象,因此有必要對(duì)其進(jìn)行遺傳檢測(cè),確定其遺傳多樣性水平,為群體遺傳保種方案的提出提供理論依據(jù)。微衛(wèi)星DNA的遺傳學(xué)穩(wěn)定性已作為衡量人類(lèi)和動(dòng)物基因組整體穩(wěn)定性的良好指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),在近交系動(dòng)物中,個(gè)體間遺傳差異小,而不同近交系之間由于近交而固定的基因不同,因此遺傳差異較大,不同品系間的微衛(wèi)星DNA具有明顯多態(tài)性,而同一品系的不同個(gè)體不具有多態(tài)性。微衛(wèi)星在小鼠等近交系動(dòng)物的遺傳檢測(cè)中已得到廣泛的應(yīng)用,但在長(zhǎng)爪沙鼠近交系中的研究國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以Z:ZCLA封閉群、野生群和近交系長(zhǎng)爪沙鼠為研究對(duì)象,篩選長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星標(biāo)記,并應(yīng)用獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記分析3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)和整體遺傳概貌,檢測(cè)群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量。通過(guò)對(duì)比Z:ZCLA封閉群和野生群,判定Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠封閉群的遺傳多樣性水平,監(jiān)測(cè)其由于長(zhǎng)期封閉可能存在的基因丟失過(guò)多和遺傳多樣性水平降低等問(wèn)題,為實(shí)現(xiàn)Z:ZCLA封閉群的可持續(xù)發(fā)展和全面實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化提供理論依據(jù)。同時(shí),通過(guò)監(jiān)測(cè)由日本國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(NIBIO)培育而成的3個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠近交系,分析這3個(gè)近交系品系內(nèi)的純度,檢測(cè)其是否符合近交系的要求,通過(guò)檢測(cè)這3個(gè)近交系品系間的多態(tài)性,以期獲得各個(gè)品系的特異性位點(diǎn)和遺傳背景標(biāo)記,為國(guó)內(nèi)長(zhǎng)爪沙鼠近交系的培育提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1長(zhǎng)規(guī)定株沙鼠Z:ZCLA封閉群長(zhǎng)爪沙鼠:浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心馴養(yǎng)的封閉群,共采集20只,雌雄各半;野生長(zhǎng)爪沙鼠:由陜西省疾病預(yù)防控制中心提供,采自陜西省定邊縣野外,共20只,雌雄各半;近交系沙鼠:3個(gè)品系是日本國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(NIBIO)培育而成,其中兩種為毛色有差異的品系:MGW(白毛品系)和MGB;MGR毛色為棕色,是抗癲癇的品系。1.1.2長(zhǎng)利益限制在長(zhǎng)7d近緣種子上的合成本次所用的17對(duì)引物參考Neumann等用克隆方法獲得的9對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠引物(AF200939、AF200940、AF200941、AF200942、AF200943、AF200944、AF200945、AF200946和AF2009417)和趙太云等從長(zhǎng)爪沙鼠近緣物種大、小鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出8個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)(D2Mit30、D6Mit102、D10Mit180、D11Mit128、ACPH、APOC3、PKC和SCN),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2方法1.2.1k-n-meq-l-4-1e-3-羥基苯基-1,3,4-二氫-3,5-四甲基-3,5-四氫-1,4-四氫-3,5-吡啶二唑3-甲基稱(chēng)取長(zhǎng)爪沙鼠肝臟0.1g,攪碎后加DNA提取液至1mL,再加10μL蛋白酶K,經(jīng)酚-氯仿抽提,GeneCleanKitⅡ(Bio101)進(jìn)行純化,晾干,加200μL雙蒸水溶解,用UV2000(Amershampharmacia)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度與濃度,調(diào)至100ng/μL,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr擴(kuò)增及電泳50μL反應(yīng)體系:100ng/μLDNA模板1.0μL,10×buffer5μL,25mmol/LMgCl23.0～7.0μL,20mmol/LdNTP4μL,1pmol/μL兩側(cè)引物各1μL,5U/μLTaq酶0.5μL,用雙蒸水補(bǔ)足50μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min,然后進(jìn)行如下35個(gè)循環(huán):94℃變性1min,復(fù)性1min,溫度因位點(diǎn)而異(50～56℃)(表1),72℃延伸2min,最后72℃延伸10min。循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%變性聚丙烯酰胺凝膠、200V電泳2h,拍照。根據(jù)不同基因片段電泳遷移率的不同,利用Kodak成像軟件KDSZD2.0計(jì)算其片段長(zhǎng)度。50bpDNAladder購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1.3統(tǒng)計(jì)方法1.3.1基因頻率利用Microsatellite-Toolkit軟件計(jì)算等位基因頻率、觀察雜合度和期望雜合度。根據(jù)Botstein等的公式計(jì)算每一個(gè)群體每一個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量。n為等位基因數(shù),pi為第i個(gè)等位基因的基因頻率,pj為第j個(gè)等位基因的基因頻率。1.3.2f-statistis的顯著性根據(jù)FSTAT程序計(jì)算F-statistics固定指數(shù),由Benferroni程序計(jì)算F-statistics的顯著性。品種間的FST值則通過(guò)GENEPOP程序算得。群體間的Reynolods’遺傳距離則由FST值算得,DR=-ln(1-FST)。1.3.3基因流動(dòng)nm群體間每代繁殖成功的遷移數(shù),由FST=1/(4Nm+1)算得。1.3.3基因型分布的穩(wěn)定性d=(Ho-He)/He一般d值越接近于零,說(shuō)明基因型分布越接近于平衡狀態(tài);d值越偏離零,基因型分布越偏離平衡狀態(tài)。d值為正說(shuō)明雜合子過(guò)剩,d值為負(fù)說(shuō)明雜合子缺失。2結(jié)果與分析2.1引物序列、復(fù)性溫度和mg2+濃度本研究所選用的17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在Z:ZCLA封閉群和野生群中共有9個(gè)獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物,分別為AF200940、AF200941、AF200942、AF200945、AF200946、AF200947、D11Mit128、PKC和SCN,各個(gè)位點(diǎn)的引物序列、復(fù)性溫度和Mg2+濃度見(jiàn)表1。在3個(gè)日本近交系中共有8個(gè)位點(diǎn)獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物,分別為AF200941、AF200942、AF200945、AF200946、AF200947、D11Mit128、PKC和SCN,復(fù)性溫度和Mg2+濃度見(jiàn)表1。2.2遺傳分化和雜合型Z:ZCLA封閉群和野生長(zhǎng)爪沙鼠群體中共檢測(cè)到41個(gè)等位基因,等位基因大小、期望雜合度、觀測(cè)雜合度和平均多態(tài)信息含量見(jiàn)表2,部分電泳圖譜見(jiàn)圖1。單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從1～7個(gè)不等,平均為4.56。對(duì)于整個(gè)群體而言,D11Mit128和PKC位點(diǎn)的期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)值最低,為0;而AF200945則擁有最高的期望雜合度和PIC值,為0.770和0.718。兩個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠群體的平均期望雜合度見(jiàn)表3,兩個(gè)群體的期望雜合度分別為:封閉群0.3704;野生群略高,為0.3893。通過(guò)每個(gè)位點(diǎn)的固定指數(shù)FIT、FIS、FST檢驗(yàn)群體的遺傳分化。兩個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠群體各個(gè)位點(diǎn)的F-statistics分析結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)于整個(gè)群體而言,平均分化系數(shù)為39.8%,群體內(nèi)雜合子過(guò)剩顯著。通過(guò)計(jì)算,兩個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠群體的Reynolds’遺傳距離為0.5075,Nm值為0.3781。兩個(gè)群體的遺傳偏離指數(shù):Z:ZCLA封閉群d值為-0.0003;野生群為0.3598,見(jiàn)表3。結(jié)果顯示Z:ZCLA封閉群的基因型分布接近于平衡狀態(tài),d值為負(fù)說(shuō)明略微表現(xiàn)有為雜合子缺失現(xiàn)象;野生群的檢測(cè)結(jié)果顯示基因型分布偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),且表現(xiàn)為雜合子過(guò)剩。2.3pcr擴(kuò)增結(jié)果在3個(gè)近交系中共有8個(gè)位點(diǎn)(AF200941、AF200945、D11Mit128、PKC、SCN、AF200942、AF200946和AF200947)獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增結(jié)果,共檢測(cè)到11個(gè)等位基因,片段大小在140～243bp之間。獲得穩(wěn)定擴(kuò)增結(jié)果的8個(gè)微衛(wèi)星引物對(duì)3個(gè)品系內(nèi)個(gè)體間的擴(kuò)增結(jié)果均顯單態(tài)性,其中5個(gè)位點(diǎn)為純合,3個(gè)位點(diǎn)為雜合,品系內(nèi)的個(gè)體均顯示了較好的一致性。3個(gè)品系間個(gè)體的擴(kuò)增結(jié)果均顯單態(tài)性,這3個(gè)近交系品系間未顯示出多態(tài)性,未能獲得各個(gè)品系的特異性位點(diǎn)和遺傳背景標(biāo)記。結(jié)果見(jiàn)表5,部分電泳圖譜見(jiàn)圖2。3討論3.1遺傳多樣性分析微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳多樣性分析,包文斌等將微衛(wèi)星標(biāo)記用于中國(guó)紅原雞和泰國(guó)紅原雞的遺傳多樣性分析,為中國(guó)家雞具有獨(dú)立的起源提供了一定的佐證;賈斌等用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)新疆8個(gè)綿羊品種作了遺傳多樣性分析;段世華等用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)我國(guó)雜交水稻主要恢復(fù)系遺傳差異作了檢測(cè)分析,但在長(zhǎng)爪沙鼠遺傳多樣性分析中的應(yīng)用還較少。在微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)中雜合度和多態(tài)信息含量是估測(cè)群體遺傳變異度的重要指標(biāo)。作為遺傳多樣性度量的最常用雜合度指的是期望雜合度,即從一個(gè)基因庫(kù)中隨機(jī)抽出的一個(gè)位點(diǎn)的兩個(gè)拷貝為不同等位基因的概率。此雜合度值越大,群體內(nèi)的遺傳變異越大。Ott將多態(tài)位點(diǎn)定義為雜合度為0.10的位點(diǎn),本研究所分析的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中,Z:ZCLA封閉群的期望雜合度為0.3704,野生群較封閉群高為0.3893,均顯示出較豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力。多態(tài)信息含量(PIC)是衡量標(biāo)記多態(tài)性較好的指標(biāo)。Bostein等提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息量指標(biāo),PIC>0.5時(shí)為高度多態(tài),0.25<PIC<0.5時(shí)為中度多態(tài),PIC<0.25時(shí)為低度多態(tài)。本研究中所檢測(cè)的長(zhǎng)爪沙鼠9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的平均多態(tài)信息含量分別為:Z:ZCLA封閉群0.3256;野生群為0.3344。表明兩個(gè)群體遺傳多樣性水平均處于中度多態(tài),且野生群要高于Z:ZCLA封閉群。有效等位基因數(shù)也是反映群體遺傳變異的一個(gè)指標(biāo),尤其在保護(hù)遺傳學(xué)中,有時(shí)更強(qiáng)調(diào)等位基因數(shù)目對(duì)種群的影響,但有效基因數(shù)目容易受到樣本量的影響。本研究的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,平均等位基因數(shù)為4.56,這說(shuō)明本研究的樣本量較為充分所選擇的微衛(wèi)星引物在兩個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠群體中所提供的多態(tài)信息含量較為豐富,用其分析遺傳多樣性具有較高的有效性和可靠性。在所分析的結(jié)果中,相對(duì)于野生長(zhǎng)爪沙鼠群體來(lái)說(shuō),Z:ZCLA封閉群的平均期望雜合度和多態(tài)信息含量以及有效等位基因數(shù)都較野生群低,這可能是由于Z:ZCLA封閉群種群數(shù)量較小,且保種時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致近交系數(shù)有所上升等原因造成的。對(duì)于封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,遺傳多樣性一般是指品種或品系內(nèi)個(gè)體在DNA水平上的差異,遺傳多樣性減少,許多有重要價(jià)值的基因可能已經(jīng)丟失,種質(zhì)質(zhì)量和育種潛力就會(huì)降低,所以必須采取科學(xué)有效的措施來(lái)保護(hù)這個(gè)品種,防止優(yōu)良基因的丟失。兩個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)為39.8%,表明兩個(gè)群體間的分化程度較大,而且呈雜合子過(guò)?，F(xiàn)象。通過(guò)計(jì)算,兩個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠群體的Reynolds’遺傳距離為0.5075,Nm值為0.3781,這兩個(gè)群體并沒(méi)有表現(xiàn)出較近的遺傳距離,且彼此之間的基因流動(dòng)較小,這可能是因?yàn)閆:ZCLA封閉群的初始群體和本研究所采集的野生沙鼠地域有差別,且經(jīng)過(guò)40多代保種封閉之后由于群體內(nèi)部分位點(diǎn)近交導(dǎo)致基因丟失等原因。本研究中通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)野生群中存在一些Z:ZCLA封閉群中沒(méi)有的基因片段,以此為參考可適當(dāng)引入野生長(zhǎng)爪沙鼠以使Z:ZCLA獲得更多的優(yōu)良基因,提高Z:ZCLA封閉群的遺傳多樣性水平,利于其遺傳育種。本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠種群結(jié)構(gòu)的分析,建立檢測(cè)遺傳多樣性的方法,為Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠封閉群的保種研究提供