cd8+cd28-細(xì)胞在近交系大鼠原位肝移植中的抑制作用

cd8+cd28-細(xì)胞在近交系大鼠原位肝移植中的抑制作用

肝移植動(dòng)物模型是移植后各種免疫反應(yīng)發(fā)生機(jī)制不可或缺的工具。近交系大鼠之間的原位肝移植存在自發(fā)免疫耐受現(xiàn)象,闡明其內(nèi)在機(jī)制具有重要意義,但前提是必須建立自發(fā)免疫耐受模型。由于嚴(yán)重缺乏近交系大鼠品系,而且近交系大鼠對(duì)手術(shù)耐受性較差,模型建立難度較大,至今國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)成功建立近交系大鼠原位肝移植自發(fā)免疫耐受模型的報(bào)道。本研究即利用所得到的近交系大鼠,建立原位肝移植自發(fā)免疫耐受模型,并初步探討CD8+CD28-T細(xì)胞在該模型中的變化以及可能作用。材料和方法1.w近交系大鼠雄性Lewis(簡(jiǎn)稱LEW)和BrownNorway近交系大鼠(簡(jiǎn)稱BN),8～10周齡,體重200～250g。均購(gòu)自北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)條件SPF級(jí)。正常供應(yīng)飼料和飲水,手術(shù)前12h禁食。2.催化劑和工料抗大鼠CD8b-RPE和抗CD28-FITC均購(gòu)自Serotec(Oxford,UK),Guineapigserum購(gòu)自GibcoBRL,RatCD8a-microbeads購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotech公司。MouseIg1anti-ratCD28mAb(NA/LE)購(gòu)自Pharmingen。3H-TDR:北京原子能研究所。RPMI1640和胎牛血清(FBS)分別為GibcoBRL和Hyclone生產(chǎn)。3.組患者手術(shù)成功標(biāo)準(zhǔn)參照Kamada的雙袖套等方法,自發(fā)耐受組:BN(供體)→LEW(受體),急性排斥組:LEW(供體)→BN(受體)。如果存活>3d,視為手術(shù)成功,<3d被認(rèn)為手術(shù)失敗,而非急性排斥相關(guān)的死亡。移植后觀察其存活時(shí)間和存活狀態(tài)。其中一部分模型分別于肝移植術(shù)后3、5、7d乙醚吸入麻醉后,放血處死,取肝組織作組織學(xué)評(píng)分。4.rai分值的計(jì)算將肝臟組織常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,RAI(rejectionactivityindex)計(jì)分。對(duì)匯管區(qū)炎癥、膽管炎癥、靜脈內(nèi)皮炎癥分別積分,最后總評(píng)。5.單個(gè)核細(xì)胞提取放血后迅速切取脾臟,將脾臟剪碎后過(guò)100目細(xì)胞篩,等密度梯度離心法即可分離到單個(gè)核細(xì)胞。6.細(xì)胞pbs和ca向所提取的淋巴細(xì)胞(各1×106)分別加入抗大鼠CD8b-RPE和抗CD28-FITC各10μl,4℃放置30min。加入抗體前后分別用含v/v1%FBS的預(yù)冷PBS洗2遍。FACSCalibur計(jì)10000個(gè)細(xì)胞,利用CellQuest軟件分析(BDBioscience,SanJose,CA)。同型對(duì)照:MousePE-IgG1,FITC-IgG1(Pharmingen,USA)。每份標(biāo)本測(cè)定2次,取均值。7.cd28+細(xì)胞利用抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體細(xì)胞毒作用,即先用Mouseanti-ratCD28mAb100μg標(biāo)記脾臟單個(gè)核細(xì)胞1×108,再與Guineapigserum共同孵育,即會(huì)特異性殺傷CD28+細(xì)胞,剩下的細(xì)胞則為CD28-細(xì)胞。再利用MACSCD8a-microbeads分選出CD28-細(xì)胞中的CD8+T細(xì)胞,最后所得到的即為CD8+CD28-T細(xì)胞。8.lew大鼠細(xì)胞的制備自發(fā)耐受組LEW大鼠的CD8-細(xì)胞(MACS陰性分選)5×105與正常BN大鼠APC(由脾臟單個(gè)核細(xì)胞過(guò)夜貼壁獲得,經(jīng)絲裂霉素處理)1∶1共同孵育,并加入LEW大鼠的5×105CD8+CD28-T細(xì)胞。以上反應(yīng)體系均為96孔板,終反應(yīng)體積200μl,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,于5%CO2,37℃條件下孵育72h,終止反應(yīng)前18h,每孔加入3H-TDR1μCi。培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞,液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值。9.統(tǒng)計(jì)處理先用F檢驗(yàn),驗(yàn)證方差齊性,再進(jìn)行t檢驗(yàn),并作Kaplan-Meier生存分析,P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性。結(jié)果1.急性排斥組大鼠一般資料變化(1)存活情況:急性排斥組10對(duì),手術(shù)成功8對(duì),自發(fā)耐受組7對(duì),手術(shù)成功5對(duì),總體手術(shù)成功率76%,急性排斥組中位生存期(9±1)d(n=8),自發(fā)耐受組3只存活超過(guò)100d,2只超過(guò)200d,最長(zhǎng)1只超過(guò)280d,中位生存期大于100d(n=3,logRank值11.1,P<0.0001)。急性排斥組術(shù)后體重持續(xù)下降,狀態(tài)差,而自發(fā)耐受組術(shù)后1周后體重和狀態(tài)開(kāi)始恢復(fù),至1個(gè)月時(shí)體重恢復(fù)至術(shù)前水平,至3個(gè)月后,與同齡正常大鼠無(wú)差別(圖1)。(2)病理學(xué)表現(xiàn):急性排斥組大鼠的肝臟腫脹,粘連,分葉不清,存活超過(guò)30d的急性排斥組大鼠肝臟呈球形皺縮,質(zhì)地硬,表面較多白色滲出物,切面質(zhì)硬;而自發(fā)耐受組存活超過(guò)100d的大鼠肝臟與正常肝臟相似。急性排斥組肝小葉匯管區(qū)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以淋巴細(xì)胞為主,并進(jìn)入膽小管上皮細(xì)胞間,膽小管上皮細(xì)胞常表現(xiàn)為空泡樣變性,匯管區(qū)門靜脈和肝小葉中央靜脈的血管內(nèi)皮呈炎性改變,血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面有淋巴細(xì)胞附著,內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜大量破壞。自發(fā)耐受組大鼠移植100d后肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)基本正常,與正常肝臟無(wú)顯著區(qū)別。2.是否較5d下降T細(xì)胞的含量變化:急性排斥組術(shù)后脾臟CD8+CD28-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的含量均無(wú)明顯變化,而且移植后30d反而較5d下降;而自發(fā)耐受組移植后第5天時(shí)即顯示CD8+CD28-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的含量均有所增加,至術(shù)后100d后,3只長(zhǎng)期存活的大鼠脾臟CD8+CD28-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的含量均顯著高于急性排斥組和正常大鼠,CD8+CD28-T細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例達(dá)30%,為急性排斥組的4～6倍,而CD8+T細(xì)胞也增加2～3倍(表1)。3.cd8+cd28-t細(xì)胞對(duì)異體混合細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用T細(xì)胞的功能:從自發(fā)耐受組脾臟分選得到CD8+CD28-T細(xì)胞,按比例加入到CD8-T細(xì)胞和供體APC的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中,結(jié)果顯示,CD8+CD28-T細(xì)胞可以明顯抑制同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(P<0.01),但急性排斥組CD8+CD28-T細(xì)胞無(wú)抑制功能(圖2)。cd8+cd28-t細(xì)胞的t抑制活性近交系動(dòng)物具有遺傳背景明確、單一以及生物學(xué)特性資料詳細(xì)等優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)時(shí)重復(fù)性好,所需動(dòng)物量小,結(jié)果具有可比性,因此對(duì)某些疾病模型的研究具有重要價(jià)值,如移植免疫學(xué),缺乏可靠的供受體遺傳背景資料的移植免疫研究其價(jià)值為零。目前國(guó)際上涉及大鼠肝移植免疫反應(yīng)的研究均采用近交系,而遠(yuǎn)交系大鼠(如SD和Wistar)僅用于研究缺血再灌注損傷等,但國(guó)內(nèi)由于嚴(yán)重缺乏近交系大鼠,僅有個(gè)別學(xué)者建立了F344和LOU/CN近交系大鼠的肝移植模型,但這種模型僅為急性排斥模型,而且國(guó)際上很少采用,至今尚未建立自發(fā)免疫耐受模型;因此,建立一種國(guó)際上公認(rèn)的近交系大鼠肝移植模型將有助于提高我國(guó)肝移植基礎(chǔ)免疫的研究水平。研究者早就發(fā)現(xiàn)某些近交系大鼠的原位肝移植存在自發(fā)免疫耐受現(xiàn)象,BN到LEW的原位肝移植也被確認(rèn)為自發(fā)免疫耐受的經(jīng)典模型之一。我們利用所得到的BN和LEW大鼠,成功建立了原位肝移植模型,并具有以下特點(diǎn):(1)所用的BN和LEW大鼠之間的MHC(RT1n和RT1l)完全不匹配;(2)3對(duì)長(zhǎng)期存活的大鼠在移植后1個(gè)月內(nèi)呈現(xiàn)體重下降等急性排斥的表現(xiàn),3個(gè)月后基本恢復(fù)正常,存活均超過(guò)100d。以上特點(diǎn)與既往報(bào)道相符,因此,本研究所建立的BN到LEW大鼠的原位肝移植模型移植結(jié)果為自發(fā)免疫耐受,同時(shí)我們也建立了LEW到BN大鼠的急性排斥模型,二者均可用于今后肝移植免疫機(jī)制的深入研究。CD8+CD28-T細(xì)胞具有抑制功能。從系統(tǒng)性紅斑狼瘡靜止期病人外周血可分離到具有抑制功能的CD8+CD28-T細(xì)胞;將外周血來(lái)源的T細(xì)胞與腸道上皮細(xì)胞共同孵育,可獲得CD8+CD28-T細(xì)胞,表達(dá)CD101和CD103,可以抑制B細(xì)胞分泌Ig和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng);體外同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),共同孵育2周后產(chǎn)生的CD8+CD28-T細(xì)胞均具有抑制功能。肝癌病人外周血CD8+CD28-T細(xì)胞含量增加。此外,從免疫耐受的臨床肝移植病人外周血也可分離到CD8+CD28-T細(xì)胞,具有抑制功能。綜上所述,CD8+CD28-T細(xì)胞可能屬于一種特殊的T抑制細(xì)胞。本研究中自發(fā)免疫耐受組脾臟CD8+CD28-T細(xì)胞含量顯著增加,而急性排斥組卻無(wú)增加,我們將自發(fā)耐受組大鼠脾臟CD8+CD28-T細(xì)胞分離純化后,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其也具