分子生物學(xué)實驗操作表達載體構(gòu)建

原核體現(xiàn)1.SHMT1基因的登陸號是At4g37930，請你根據(jù)這個登陸號在基因庫里查找該基因編碼區(qū)的序列，設(shè)計添加酶切位點的特異引物，通過PCR擴增出來，再亞克隆到T載體中，然后用pET28a構(gòu)建SHMT1基因的原核體現(xiàn)載體，體現(xiàn)SHMT1基因編碼的重組蛋白，預(yù)測重組蛋白的分子量，并用親和層析純化重組蛋白，請用圖解的方式寫出你的實驗方案。酶切位點：BamHI(GGATTC)XhoI(CTCGAG)Sequence(5'->3') Length Tm GC% ForwardprimerGGATTCCCAGAGATAGAGAGAGGTTTAGCG 24 59.78 50.00ReverseprimerCTCGAGACACTTGTGGGGTGAAACAG20 58.24 50.00 （注:如果PCR產(chǎn)物連接T載體再酶切，就沒有必要加保護堿基；如果是PCR產(chǎn)物回收后直接酶切，還是加上保護堿基的好（由于保護堿基對內(nèi)切酶切割DNA有很大影響）保護堿基普通都加在5‘端，如果兩端都加的話，將造成目的基因上引入若干個堿基序列，如果是基因體現(xiàn)實驗的話，有可能造成下游基因移碼突變。)8.SHMT1基因PCR擴增和亞克隆到T載體（TA克?。?.載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞10.陽性克隆檢測PCR檢測;限制性酶切分析；菌液測序11.pET28a構(gòu)建SHMT1基因的原核體現(xiàn)載體12.SHMT1在大腸桿菌中的體現(xiàn)與純化13.重組蛋白的分子量預(yù)測2.請根據(jù)MS基因登陸號NM_120467在基因庫里查找該基因編碼區(qū)的序列，設(shè)計添加酶切位點的特異引物，通過PCR擴增出來，再亞克隆到T載體中，然后用pGEX-4T-1構(gòu)建MS基因的原核體現(xiàn)載體，體現(xiàn)MS基因編碼的重組蛋白，預(yù)測重組蛋白的分子量，并用親和層析純化重組蛋白，請用圖解的方式寫出你的實驗方案。酶切位點：SmaIccc|gggNotIgc|ggccgcSequence(5'->3') Length Tm GC% Forwardprimer 5'CCCGGGCACATGTCAATGCGTTTCACCGATT3'21 52.638.1Reverseprimer5'GCGGCCGCTCTTCTTTCTTTCAGAGCCT3' 20 51.140Productlength 17938.載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞9.陽性克隆檢測PCR檢測;限制性酶切分析；菌液測序10.pGEX-4T-1構(gòu)建MS基因的原核體現(xiàn)載體11.MS在大腸桿菌中的體現(xiàn)與純化酵母體現(xiàn)載體技術(shù)有關(guān)作業(yè)1、根據(jù)文獻報道推測煙草中14-3-3c蛋白和MDH蛋白可能有互相作用，下列給出這兩個蛋白編碼區(qū)的序列，請你設(shè)計引物擴增這兩個基因的編碼區(qū)序列，TA克隆測序確認無誤后亞克隆于酵母雙雜交載體中，轉(zhuǎn)化酵母菌在酵母系統(tǒng)中進一步驗證這兩種蛋白的互相作用，請用圖解的方式描述你的實驗方案。植物體現(xiàn)載體根據(jù)文獻報道推測煙草中14-3-3c蛋白和MDH蛋白可能有互相作用，下列給出這兩個蛋白編碼區(qū)的序列，請你設(shè)計引物擴增這兩個基因的編碼區(qū)序列，TA克隆測序確認無誤，然后構(gòu)建這兩個基因的過體現(xiàn)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的辦法轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植物，再檢測轉(zhuǎn)基因的插入和轉(zhuǎn)錄水平。并通過兩種技術(shù)驗證這兩種蛋白的互相作用，請用圖解的方式描述你的實驗方案。1核小體（nucleosome）：核小體是由DNA和組蛋白形成的染色質(zhì)基本構(gòu)造單位。每個核小體由147bp的DNA纏繞組蛋白八聚體近兩圈形成。核小體核心顆粒之間通過60bp左右的連接DNA相連。染色質(zhì)就是由一連串的核小體所構(gòu)成。上面有H1（H5）、H2A、H2B、H3和H4組蛋白。2端粒(Telomeres)：是存在于真核細胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”構(gòu)造，作用是保持染色體的完整性和控制細胞分裂周期。3CpG島(CpGisland):哺乳動物DNA中5’—CG—3’序列普通在胞嘧啶堿基處被甲基化，它與染色質(zhì)中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)相連?；蚪M中尚有未甲基化的CpG“島”，包圍著持家基因的啟動子區(qū)域。4中心法則（geneticcentraldogma）：是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA,再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程,以及遺傳信息從DNA傳遞給DNA的復(fù)制過程.5原癌基因（proto-oncogene）：是細胞內(nèi)與細胞增殖有關(guān)的基因，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高度保守。當(dāng)原癌基因的構(gòu)造或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細胞過分增殖，從而形成腫瘤。6遺傳密碼（

geneticcode）：遺傳密碼又稱密碼子、遺傳密碼子、三聯(lián)體密碼。指信使RNA(mRNA）分子上從5'端到3'端方向，由起始密碼子AUG開始，每三個核苷酸構(gòu)成的三聯(lián)體。它決定肽鏈上每一種氨基酸和各氨基酸的合成次序，以及蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止。7開放閱讀框（OpenReadingFrame,ORF）：開放閱讀框[openreadingframe，ORF]是構(gòu)造基因的正常核苷酸序列，從起始密碼子到終止密碼子的閱讀框可編碼完整的多肽鏈，其間不存在使翻譯中斷的終止密碼子。8核酶（ribozyme）：是含有催化功效的RNA分子，是生物催化劑，可降解特異的mRNA序列。核酶又稱核酸類酶、酶RNA、核酶類酶RNA。它的發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。有某些RNA分子同樣含有催化功效。9啟動子（Promoters）是基因（gene）的一種構(gòu)成部分，控制基因體現(xiàn)（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和體現(xiàn)的程度。啟動子（Promoters）就像“開關(guān)”，決定基因的活動。啟動子是一段位于構(gòu)造基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA精確地相結(jié)合并含有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。10DNA構(gòu)造域（DNAbindingdomains）：基因組由50—100個長度為50—100kb的環(huán)或構(gòu)造域構(gòu)成，與膜蛋白復(fù)合體結(jié)合而被固定。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)造域:兩個α-螺旋由一種β-轉(zhuǎn)角分開，識別的α-螺旋與DNA發(fā)生作用。鋅指構(gòu)造域，有兩種：C2H2型鋅指有一種12氨基酸的環(huán)，通過2個半胱氨酸和2個組氨酸殘基固定與鋅離子形成4面體構(gòu)造，普通需要3個或更多的C2H2型鋅指才干與DNA結(jié)合；C4鋅指構(gòu)造由4個半胱氨酸與鋅離子結(jié)合而成。堿性構(gòu)造域，普通與亮氨酸拉鏈或HLH基序中的一種聯(lián)合一起，又稱堿性亮氨酸拉鏈或堿性HLH蛋白。11連接DNA(LinkerDNA):核小體間由連接DNA串聯(lián)，平均長度為55bp，不同組織中其長度在0—100bp內(nèi)變化。12質(zhì)粒（plasmid）：質(zhì)粒（Plasmid）是一類存在于細菌和真菌細胞中獨立于染色體DNA而自主復(fù)制的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA）,也稱為cccDNA,其大小普通在1~100KB范疇內(nèi)。13NoncodingDNA(非編碼DNA):復(fù)雜的真核生物基因組DNA是原核生物的1000多倍，但大部分不編碼蛋白質(zhì)，其編碼區(qū)被內(nèi)含子中斷。這些非編碼DNA大部分由多重拷貝構(gòu)成，這些拷貝能夠是串聯(lián)重復(fù)的（如衛(wèi)星DNA）或是分散于基因組中（如分散的Alu元件）。14外顯子（exon）:既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的RNA

分子中的核苷酸序列。術(shù)語外顯子也指DNA

中編碼對應(yīng)RNA

的區(qū)域。

15生長因子(growthfactor)：是經(jīng)許多個細胞分泌到體液中的肽，它能夠與附近的組織細胞（能夠是與分泌細胞相似或不同的細胞）上的特異性細胞表面受體結(jié)合，并普通激起造成細胞分裂速率增加的應(yīng)答反映16噬菌體（bacteriophage或phage）:是侵染細菌的病毒。它們的基因能夠是RNA或DNA，大小能夠從2.5kb到150kb。它們的生活周期能夠很簡樸或更復(fù)雜且高度受控，后涉及基因組整合或轉(zhuǎn)座。17上游結(jié)合因子（Upstreambindingfactor(UBF)）:上游結(jié)合因子（UBF）,與UCE結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，使轉(zhuǎn)錄效率大大增強。上游結(jié)合因子(UBF)是一種特異DNA結(jié)合蛋白，能夠與UCE結(jié)合外，UBF還可與核心元件上游的的一段序列結(jié)合。兩個UBF結(jié)合位點的序列間沒有明顯的相似性。普通認為UBF的一種分子結(jié)合一種序列元件。隨即兩個UBF分子可通過蛋白－蛋白互相作用而互相作用而互相結(jié)合，造成在兩個結(jié)合位點間的DNA形成一種環(huán)狀構(gòu)造。當(dāng)UBF缺少時能夠觀察到低水平的本底轉(zhuǎn)錄，而在UBF存在下，轉(zhuǎn)錄速率會大大增強。18癌基因(oncogene):體現(xiàn)后能夠引發(fā)細胞癌化的基因，相對于為突變的基因，癌基因是處在遺傳顯性狀態(tài)的基因。19轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)：是一群能與基因5`端上游特定序列專一性結(jié)合，從而確保目的基因以特定的強度在特定的時間與空間體現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子。它由兩個構(gòu)造域構(gòu)成：DNA結(jié)合構(gòu)造域（DNA-bindingdomains）和激活構(gòu)造域（activa