吡格列酮、高糖對3T3

吡格列酮、高糖對3T3—L1細(xì)胞中p—Perilipin1A蛋白表達(dá)的影響目的探討毗格列酮和高糖對3T3-L1細(xì)胞中p-Perilipin1A蛋白表達(dá)的影響。方法將以3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞，進(jìn)行分組，設(shè)對照組(5mmol/L葡萄糖)、高糖組(25mmol/L葡萄糖)、高糖加毗格列酮組(25mmol/L葡萄糖+100pmol/L毗格列酮)，通過測定培養(yǎng)基中甘油含量作為評價(jià)脂肪分解的指標(biāo)，同時(shí)用Westernblot檢測p-Perilipin1A蛋白表達(dá)。結(jié)果通過甘油試劑盒監(jiān)測甘油釋放量，高糖組較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.01)，而高糖加毗格列酮組的甘油釋放量較高糖組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.01)；同時(shí)Westernblot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組p-Perilipin1A蛋白明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.01)，高糖組與高糖加毗格列酮組比較，顯著抑制了p-Perilipin1A蛋白的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.01)。結(jié)論毗格列酮可能通過阻止p-Perilipin1A上調(diào)來抑制高糖刺激下的脂肪分解，減少游離脂肪酸，從而改善胰島素抵抗。［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheeffectsofpioglitazoneandhighglucoseontheexpressionofp-Perilipin1Aproteinin3T3-L1cells.Methods3T3-L1preadipocyteswereinducedanddifferentiatedinto3T3-L1adipocytesandthenwereclassifiedintothreegroups：controlgroup(5mmol/Lglucose)，highglucosegroup(25mmol/Lglucose)andhighglucoseplusPioglitazonegroup(25mmol/Lglucose+100pmol/LPioglitazone).Theglycerolcontentofculturemediumwasdeterminedandtakenastheevaluationindexoflipolysis；atthesametime，Westernblotwasusedtodetecttheexpressionofp-Perilipin1Aprotein.ResultsAccordingtothereleaseamountofglycerolmonitoredbyusingtheglycerolkit，amoreobviousincreasewasseeninhighglucosegroupthanincontrolgroup，withstatisticallysignificantdifference(PV0.01)；while，amoreobviousdecreaseofthereleaseamountofglyceroloccurredinhighglucoseplusPioglitazonegroupthanthatinhighglucosegroup，withstatisticallysignificantdifference(PV0.01)；atthesametime，thep-Perilipin1AproteinofhighglucosegroupdetectedbyWesternblotwassignificantlyincreasedincomparisonwithcontrolgroup，withstatisticallysignificantdifference(PV0.01)；andtheexpressionofp-Perilipin1Aproteinwassignificantlyinhibitedinhighglucosegroupincontrastwithhighglucosepluspioglitazonegroup，withstatisticallysignificantdifference(PV0.01).ConclusionPioglitazonemaypreventtheup-regulationofp-Perilipin1Atoinhibitglucose-stimulatedlipolysisanddecreasefreefattyacids，therebyimprovingtheinsulinresistance.［Keywords］Pioglitazone；Highglucose；3T3-L1cells；p-Perilipin1A目前代謝綜合征的發(fā)病率正以驚人的速度上升［1］，脂代謝紊亂是代謝綜合征的病理特點(diǎn)，因?yàn)樵谘h(huán)中增加了源自脂肪鮑織的非酯化游離脂肪酸(freefattyacid，F(xiàn)FA)［2］。這些FFA可以引發(fā)肌肉、肝臟處胰島素抵抗［3］。FFA的濃度主要由脂肪細(xì)胞的脂肪分解控制。周脂素(PLIN1，Perilipin1A)能雙重調(diào)控脂類代謝［4］，Perilipin1A表達(dá)下降和磷酸化上調(diào)都能促進(jìn)脂解，誘發(fā)胰島素抵抗［5］。目前，研究已明確噻唑烷二酮類誘導(dǎo)調(diào)節(jié)糖、脂代謝的相關(guān)蛋白表達(dá)而減輕胰島素抵抗［6］，但是如何調(diào)節(jié)脂代謝的相關(guān)蛋白表達(dá)以改善胰島素抵抗作用的研究尚不多。而本文旨在研究毗格列酮在3T3-L1細(xì)胞是否可通過抑制高糖刺激下的脂滴包被蛋白p-Perilipin1A蛋白的表達(dá)上調(diào)來減少脂肪分解進(jìn)一步減少FFA，以助于減輕胰島素抵抗。1材料與方法1.1主要試劑3T3-L1前脂肪細(xì)胞株（美國模式培養(yǎng)物集存庫提供）、葡萄糖（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）、地塞米松（D4902）、1-甲基-3-異丁基-黃嘌（15879）、無酚紅DMEM培養(yǎng)基（美國Sigmag公司）、胰蛋白酶、5mmol/L無酚紅葡萄糖（DMEM）培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、兔抗牛p-Perilipin1A抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司）、胰島素（諾和諾德公司）、毗格列酮（原料，純度99.3%，江蘇漣水制藥有限公司）、胎牛血清（美國PAA公司）、甘油檢測試劑盒（上海超研生物科技有限公司）、Westernblot試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）。1.2實(shí)驗(yàn)方法3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞以含10%胎牛血清（DMEM）培養(yǎng)基，在室溫、體積分?jǐn)?shù)為0.07的CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞融合率為80%?90%時(shí)，行傳代接種。細(xì)胞融合后，加含誘導(dǎo)液（地塞米松、胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌吟）的DMEM培養(yǎng)液再孵育2d；然后以含10pg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)液孵育2d，隨后以DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育6d，3T3-L1細(xì)胞在誘導(dǎo)分化約10d90%呈脂肪細(xì)胞表型［7］。3T3-L1脂肪細(xì)胞分組將3T3-L1脂肪細(xì)胞分為三組:對照組（5mmol/L葡萄糖）（第1組）、高糖組（25mmol/L葡萄糖）（第2組）、高糖+毗格列酮組（25mmol/L葡萄糖+100pmol/L毗格列酮）（第3組）。每組細(xì)胞以5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化12h后，第3組無血清培液中加入吡格列酮，摸索濃度（0、20、40、60、80、100pmol/L）達(dá)終濃度100pmol/L，預(yù)處理3h后，第2組和第3組中加入葡萄糖，終濃度25mmol/L，溫育24h。3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的測定將脂肪細(xì)胞進(jìn)行分組，衡量脂肪細(xì)胞分解的指標(biāo)是以孵育后測定培養(yǎng)基中甘油累積量。將細(xì)胞孵育一定時(shí)間后用GPO-POD酶法直接測定培養(yǎng)基中甘油含量作為累積值。具體在酶標(biāo)板中每組各設(shè)置5個(gè)孔，將50pl無酚紅DMEM培養(yǎng)液中加入150pl工作液中，室溫靜置15min，于光密度550波長處比色［8］。繪制曲線計(jì)算甘油濃度。Westernblot檢測p-Perilipin1A蛋白的表達(dá)將總蛋白樣品用SDS電泳進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，常溫下以5%脫脂奶粉封閉，加入p-Perilipin1A多克隆抗體孵育12h以上，洗滌后，加入辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的II抗室溫孵育1h，再洗滌，ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進(jìn)行定量掃描。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X土S）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以PV0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1毗格列酮對高糖誘發(fā)的3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響第2組的甘油量比第1組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV0.01）,第3組較第2組甘油釋放量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV0.01），而第1組和第3組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。2.2毗格列酮對p-Perilipin1A蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，第2組中p-Perilipin1A蛋白的表達(dá)明顯增加，與第1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV0.01）；第3組與第2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV0.01），而與第1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），光密度掃描圖和分析見圖2。3討論代謝綜合征是一組復(fù)雜的代謝紊亂群，包括脂代謝紊亂，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］，還與其他一系列疾病的發(fā)生率和死亡率密切相關(guān)。有效地封存脂肪可以防止肌肉和肝臟中脂肪酸過度，而破壞代謝綜合征發(fā)生的信號途徑［10］。Perilipin1A是屬于最早發(fā)現(xiàn)的脂滴相關(guān)蛋白PAT家族，參與脂肪細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的合成與分解，對糖脂代謝平衡起著關(guān)鍵作用［11］。在正常生理?xiàng)l件下，由兒茶酚胺通過提高細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度并激活cAMP依賴的蛋白激酶PKA，磷酸化p-Perilipin1A，引發(fā)脂解［12］，且Perilipin的磷酸化是脂解的關(guān)鍵［13］，由此產(chǎn)生適量FFA為機(jī)體供能，保持脂代謝平衡。代謝綜合征患者的FFA升高，原因之一，Perilipin1A的表達(dá)減少和磷酸化的Perilipin1A增加，低水平的Perilipin1A和高水平的p-Perilipin1A與高脂解率相關(guān)［14］。代謝綜合征患者內(nèi)源性刺激脂解因子的分泌水平增加，如炎癥因子TNF-a、IL-6的分泌等。而最近幾年人們已發(fā)現(xiàn)存在多種抑制劑可以對這些內(nèi)源性刺激脂解的因子及其信號通路進(jìn)行抑制，逆轉(zhuǎn)Perilipin1A的改變，減少脂解。如羅格列酮和橘皮素可以抑制NF-kB的信號通路，柚皮素可以抑制IL-6的轉(zhuǎn)錄，并能抑制TNF-a和IL-6介導(dǎo)Perilipin1A的下調(diào)［15］。目前高血糖對Perilipin1A磷酸化的影響研究非常少，而高血糖是代謝綜合征的組成部分，因此本研究選擇了以高糖作為刺激脂肪分解的因子，研究發(fā)現(xiàn)，3T3-L1脂肪細(xì)胞在高糖刺激下，高糖組的甘油釋放量明顯較對照組升高，根據(jù)Westernblot法檢測p-Perilipin1A蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)顯示，同時(shí)高糖組的p-Perilipin1A蛋白較對照組增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本研究顯示高濃度葡萄糖（25mmol/L）可以提高Perilipin1A的磷酸化水平，與Zhang等［16］的研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果顯示，主要信號通路可能包括持續(xù)激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷脂酶C（PLC），隨之下游信號蛋白激酶C（PKC）、絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶/胞外調(diào)節(jié)號1/2（MAPK/ERK1/2）和胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）激活而調(diào)節(jié)。在降血糖的桑物中，噻唑烷二酮類藥物毗格列酮，對改善胰島素抵抗有著顯著的效能[17]。毗格列酮是PPARy激動(dòng)劑。已有研究表明PPARy這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與代謝紊亂的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，毗格列酮可通過PPARy通路調(diào)節(jié)多種信號因子，影響3T3-L1細(xì)胞脂肪形成[18]，故推測毗格列酮是否可以逆轉(zhuǎn)Perilipin1A磷酸化的改變，減少脂解。本研究通過測定甘油釋放量，毗格列酮預(yù)處理后，可以抑制高糖引發(fā)的脂肪分解，脂肪分解率明顯降低，與高糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)根據(jù)Westernblot法檢測p-Perilipin1A蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)顯示，發(fā)現(xiàn)p-Perilipin1A蛋白表達(dá)下調(diào)，說明毗格列酮可以抑制高糖刺激的p-Perilipin1A蛋白的上調(diào)，進(jìn)一步闡述了高糖刺激下，毗格列酮仍可以通過減少Perilipin1A的磷酸化，減少脂肪分解，則最終可以改善胰島素抵抗。綜上所述，在代謝綜合征患病率急速上升的趨勢下，需要尋找有效的藥物來控制各項(xiàng)代謝危險(xiǎn)因素，本研究發(fā)現(xiàn)p-Perilipin1A蛋白可作為一治療靶點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞的脂肪分解，改善胰島素抵抗，同時(shí)發(fā)現(xiàn)毗格列酮藥物可以有效抑制Perilipin1A的磷酸化，減少脂肪分解，但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。[參考文獻(xiàn)]KriksciunieneR，ZilaitieneB，VerkauskieneR.Thecurrentmanagementofturnersyndrome[J].MinervaEndocrinol，2016，41（1）：105-121.BodenG.Doesinhibitionof。-cellproliferationbyfreefattyacidinmiceexplaintheprogressivefailureofinsulinsecretionintype2diabetes？[J].Diabetes，2012，61（3）：560-561.VnelakJ，VejrankovaD，VankovaM，etal.T2DriskhaplotypesoftheTCF7L2geneintheCzechpopulationsample:theassociationwithfreefattyacidscomposition[J].PhysiolRes，2012，61（3）：229.KimmelAR，SztalrydC.Theperilipins:majorcytosoliclipiddroplet-associatedproteinsandtheirrolesincellularlipidstorage，mobilization，andsystemichomeostasis[J].AnnualReviewofNutrition，2016，36（1）：471.MiyoshiH，SouzaSC，ZhangHH，etal.Perilipinpromoteshormone-sensitivelipase-mediatedadipocytelipolysisviaphosphorylation-dependentand-independentmechanisms[J].JBiolChem，2006，281（23）：15837.ChenHH，HorngMH，YehSY，etal.GlycemiccontrolwithThiazolidinedioneisassociatedwithfractureofT2DMPatients[J].PlosOne，2015，10（8）：e0135530.王麗靜，張尉，劉小鶯，等地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41（3）：282-284.夏文燕，王麗靜，劉小鶯，等.牛黃熊脫氧膽酸抑制TNF-a刺激3T3-L1細(xì)胞脂肪分解[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（12）：1206-1209.BibraHV，Str?hleA，SuttonMSJ，etal.Dietarytherapyinheartfailurewithpreservedejectionfractionand/orleftventriculardiastolicdysfunctioninpatientswithmetabolicsyndrome[J].IntJCardiol，2017，234：7-15.Adams-HuetB，DevarajS，SiegelD，etal.Increasedadiposetissueinsulinresistanceinmetabolicsyndrome：relationshiptocirculatingadipokines[J].MetabSyndrRelatDisord，2014，12（10）：503-507.WesthoffCC，MrozinskiJ，RiedelI，etal.Perilipin1isahighlyspecificmarkerforadipocyticdifferentiationinsarcomaswithintermediatesensitivity[J].JCancerResClinOncol，2017，143（2）:225-232.[12]McdonoughPM，Maciejewski-LenoirD，HartigSM，etal.Differentialphosphorylationofperilipin1Aattheinitiationoflipolysisrevealedbynovelmonoclonalantibodiesandhighcontentanalysis[J].PloSOne，2013，8（2）：e55511.ElkinsDA，SpurlockDM.PhosphorylationofperilipinisassociatedwithindicatorsoflipolysisinHolsteincows[J].HormMetabRes，2009,41（10）：736-740.MulumbaM，GranataR，MarleauS，etal.QRFP-43inhibitslipolysisbypreventingligand-inducedcomplexformationbetweenperilipi