首烏方與美多芭對帕金森病模型大鼠腦內(nèi)微透析及腦內(nèi)紋狀體神經(jīng)化學(xué)作用的比較

首烏方與美多芭對帕金森病模型大鼠腦內(nèi)微透析及腦內(nèi)紋狀體神經(jīng)化學(xué)作用的比較

烏烏配方主要用于肝腎經(jīng)絡(luò)的何首烏和鹿毛，具有肝腎、強(qiáng)筋和強(qiáng)骨的功效。輔以天麻、鉤藤、平肝祛風(fēng)；以厚樸為基礎(chǔ)，祛瘀消粘液，補(bǔ)充肝腎、精血、祛風(fēng)止息作用。是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下針對帕金森病(PD)病機(jī)優(yōu)選的自擬中藥組方。應(yīng)用本方配合美多芭臨床治療70例PD患者,取得了比單用美多芭組更為顯著的臨床血糖-濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)療效。我課題組近期應(yīng)用血、腦雙位點(diǎn)微透析采樣技術(shù),同步觀察6-羥基多巴胺(6-OHDA)所致的PD大鼠模型血液和紋狀體細(xì)胞外液中左旋多巴(L-DOPA)藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果表明:首烏方可改善L-DOPA的藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo),提高血藥濃度,增加AUC,并使其體內(nèi)滯留時(shí)間延長;穩(wěn)定紋狀體細(xì)胞外液L-DOPA藥物濃度,減少其波動(dòng),減慢L-DOPA的消除。本文就首烏方與美多芭(L-DOPA的復(fù)方制劑)同用對PD模型大鼠紋狀體細(xì)胞外液神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的影響,采用應(yīng)用清醒自由活動(dòng)大鼠腦內(nèi)微透析及其相關(guān)檢測技術(shù),從PD模型大鼠紋狀體細(xì)胞外液神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)水平進(jìn)行探討,為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療PD增效減毒的機(jī)制提供藥理學(xué)依據(jù)。1材料表面1.1動(dòng)物SD大鼠,雄性,體重200～250g,中國藥品生物制品檢定所,許可證號SCXK(京)2005-0004。1.2水提物的提取效果首烏方(何首烏20g,鹿茸2g,天麻10g,鉤藤15g,厚樸15g)為本實(shí)驗(yàn)室自制:按常規(guī)水煎2次,合并、濃縮后加入鹿茸勻漿,為含生藥量1.8g·mL-1的水提物。L-DOPA注射液(上海福達(dá)制藥有限公司產(chǎn)品,批號040701),復(fù)方氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,批號0807092),鹽酸芐絲肼、水楊酸鈉、6-羥基多巴胺、辛烷磺酸鈉、磷酸、多巴胺(DA)、3,4二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、2,3-二羥基苯甲酸(2,3-DHBA)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHBA)、高氯酸(HCLO4)均購自Sigma公司,乙腈、乙酸和甲醇(FisherChemicals公司產(chǎn)品)。1.3ma/400低溫樣品自動(dòng)收集器和轉(zhuǎn)化動(dòng)物活動(dòng)裝置微透析系統(tǒng)CMA/12腦部探針(透析膜長4mm)及探針套管、CMA/402微量泵、CMA/470低溫樣品自動(dòng)收集器(瑞典CMA公司),五通轉(zhuǎn)環(huán)清醒動(dòng)物活動(dòng)裝置(美國Instech公司)。手術(shù)使用設(shè)備:立體定位儀STRONG8003、動(dòng)物體溫維持儀269001、顱鉆/90-102(深圳瑞沃德公司)。高效液相色譜檢測系統(tǒng)(德國SykamS-2100)。2方法2.1目的物的提取大鼠隨機(jī)分為4組,對照組、模型組、美多芭組、首烏方+美多芭組,每組6只。大鼠ip1%戊巴比妥鈉(40mg·kg-1),于麻醉下埋入探針套管于紋狀體內(nèi)(A:+0.2mm,L:+3mm,V:7.5mm),用牙科水泥固定。各造模組向紋狀體緩慢ip0.2%的6-OHDA生理鹽水溶液(32μg·kg-1,1μL·min-1),對照組ip相應(yīng)體積的生理鹽水。造模當(dāng)天開始ig投藥至第6天,美多芭組30mg·kg-1,(L-DOPA24mg·kg-1、鹽酸芐絲肼6mg·kg-1);首烏方+美多芭組:首烏方水提物(生藥量:18g·kg-1·d-1)+美多芭(用量同前);其他組ig等量常水,每日1次。第7天于大鼠清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下插入腦探針,進(jìn)行腦內(nèi)微透析。腦內(nèi)探針用5mmol·L-1水楊酸鈉林格液灌流,灌流速度均為2.5μL·min-1,平衡60min之后開始收集透析液,每15min收集1管。取前4管透析液測定目標(biāo)檢測物,計(jì)算均值作為基礎(chǔ)水平(0min)。之后,給藥組大鼠ip美多芭注射液(配比及給藥劑量同前),對照組和模型組ip等量生理鹽水,收集紋狀體透析液至給藥后360min。2.2分析柱和催化劑高效液相色譜-電化學(xué)(HPLC-ED)法測定紋狀體透析液中DA,HVA,2,3DHBA,2,5DHBA含量。色譜柱為AntecLeydenBVC18分析柱(2.1mm×100mm,3μm)。AntecDecadeⅡSDC電化學(xué)檢測器,玻璃碳電極和Ag/AgCl參考電極,工作電壓為0.52V。流動(dòng)相乙二胺四乙酸二鈉(0.027mmol·L-1)、辛烷磺酸鈉(0.74mmol·L-1)、氯化鉀(2mmol·L-1)、磷酸二氫鈉(100mmol·L-1)、甲醇(15%)、乙睛(1%)、乙酸(0.05%),用磷酸調(diào)pH至3.32。流速0.2mL·min-1,進(jìn)樣量20μL。2.3探針的體外回收率將探針放置于DA,DOPAC,HVA,2,3-DHBA,2,5-DHBA的混合標(biāo)準(zhǔn)液中,保持溫度為37℃,用復(fù)方氯化鈉2.5μL·min-1灌流,每15min1管,連續(xù)收集透析液,共3管,HPLC-ED法測定體外透析液中上述物質(zhì)的濃度。每種物質(zhì)的探針體外回收率=(3管透析液該物質(zhì)濃度均值/3管標(biāo)準(zhǔn)液該物質(zhì)濃度均值)×100%。體外回收率用于折算腦微透析液中目標(biāo)檢測物的濃度。2.4單因素方差分析計(jì)量資料以xˉ±sxˉ±s表示,多組比較采用SPSSforwindows16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1各組da基礎(chǔ)水平的比較6-OHDA造模使模型組紋狀體細(xì)胞外液DA水平在基礎(chǔ)和給藥后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)較對照組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。美多芭、首烏方+美多芭投藥6日使DA基礎(chǔ)水平均較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01),兩組間無顯著差異。腹腔注射美多芭后,兩組DA水平均迅速升高,然后緩慢回落。與模型組相比,美多芭組有5個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著升高(P<0.05),首烏方+美多芭組有14個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著升高(P<0.05,P<0.01),且在30min時(shí)高于美多芭組(P<0.05),見表1。3.2模型組和模型組hva/da的比率PD大鼠紋狀體細(xì)胞外液DOPAC/DA,HVA/DA比率反映DA代謝速率。6-OHDA造模后第7天,模型組DOPAC/DA,HVA/DA比率較對照組升高(P<0.05,P<0.01),而美多芭組、首烏方+美多芭組較模型組降低(P<0.01)。ip美多芭后,由于DA水平升高,兩組的兩個(gè)比率一過性降低,之后伴隨DA的代謝、DOPAC,HVA水平增高,兩個(gè)比率均隨之升高,組間無差異。首烏方對腹腔注射美多芭后DA代謝速率動(dòng)態(tài)變化情況無顯著影響。3.3l-dopa抑制活性為能清晰反映單次給藥后紋狀體細(xì)胞外液DA水平波動(dòng)情況,以給藥6日后測得0min的DA濃度作為基礎(chǔ),用(給藥后各時(shí)間點(diǎn)的DA濃度-基礎(chǔ)濃度)/基礎(chǔ)濃度,反映給藥后DA的變化率(ΔDA),結(jié)果如表2所示。對照組和模型組ip生理鹽水后,ΔDA動(dòng)態(tài)變化較小,為生理性波動(dòng);ip美多芭后,ΔDA有8個(gè)時(shí)間點(diǎn)較模型顯著升高(P<0.05,P<0.01),表明外源性L-DOPA引起的DA波動(dòng)性較大;而首烏方+美多芭組因其DA基礎(chǔ)水平較高,ΔDA只有3個(gè)時(shí)間點(diǎn)較模型組顯著升高(P<0.05,P<0.01),且大多時(shí)間點(diǎn)的變化幅度低于美多芭組,見表2。由此可見首烏方使PD模型大鼠紋狀體細(xì)胞外液DA濃度更長時(shí)間維持在較高水平,同時(shí)使L-DOPA引起的ΔDA經(jīng)時(shí)曲線波動(dòng)平緩,從而減少DA受體的脈沖樣刺激。3.4模型和模型的比較2,3-DHBA與2,5-DHBA為羥自由基指標(biāo),二者之和反映羥自由基總水平。模型組大鼠紋狀體細(xì)胞外液2,3-DHBA+2,5-DHBA濃度較對照組升高,7個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著意義(P<0.05,P<0.01)。美多芭組、首烏方+美多芭組與模型組相比,基礎(chǔ)水平降低(P<0.05),并在腹腔注射美多芭后,持續(xù)低于模型組,分別有4個(gè)和20個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性意義(P<0.05,P<0.01)。首烏方+美多芭組在觀察時(shí)間內(nèi)各點(diǎn)始終低于美多芭組,其中9個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性意義(P<0.05),見表3。4如何高效地使用l-dopa,保護(hù)da神經(jīng)元目前,PD最為常用和有效的治療藥物仍是L-DOPA及其復(fù)方制劑。它可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為DA,發(fā)揮替代治療作用,可以減輕PD癥狀,延緩病程進(jìn)展,延長患者壽命,是PD治療史上的重大進(jìn)展。可是隨著用藥時(shí)間延長和劑量加大,非但不能取得進(jìn)一步的療效,反而產(chǎn)生病人難以耐受的副作用。有研究表明,L-DOPA副作用產(chǎn)生的基礎(chǔ)是PD的嚴(yán)重程度,始動(dòng)因素是L-DOPA的波動(dòng)性變化,引起紋狀體DA受體“脈沖”樣刺激;此外,PD導(dǎo)致機(jī)體自由基清除系統(tǒng)功能低下,外源性L-DOPA自身代謝過程中產(chǎn)生的羥自由基不能被有效清除,會(huì)進(jìn)一步加重DA神經(jīng)元的損傷。因此,如何科學(xué)合理地使用L-DOPA,以較小的劑量,發(fā)揮較大的生物效應(yīng),減少不良反應(yīng),是PD臨床治療和基礎(chǔ)研究所面臨的重要課題。以往的藥理學(xué)研究顯示,首烏方中的何首烏和鹿茸均具延緩衰老、抗氧化、抑制腦內(nèi)單胺氧化酶-B、改善學(xué)習(xí)記憶等作用。何首烏尚促進(jìn)細(xì)胞代謝、防止紋狀體中間神經(jīng)元數(shù)量減少,提高D2受體水平;鹿茸尚有神經(jīng)生長因子樣作用,能刺激神經(jīng)纖維的生長,誘導(dǎo)分化期細(xì)胞形態(tài)的改變,使微管、微絲等管狀細(xì)胞器開始增加,影響PC-12細(xì)胞的DNA合成。天麻、鉤藤也有抑制血清和腦過氧化脂質(zhì)生成、增強(qiáng)過氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的作用等。但該復(fù)方與L-DOPA協(xié)同作用、減毒增效的機(jī)制未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在我室以往工作的基礎(chǔ)上抓住PD進(jìn)程和L-DOPA治療過程中關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵環(huán)節(jié),應(yīng)用先進(jìn)的微透析采樣技術(shù),在觀察首烏方對PD大鼠L-DOPA藥動(dòng)學(xué)影響的同時(shí),觀察對L-DOPA藥效學(xué)、副作用的影響,深入探討首烏方協(xié)同L-DOPA治療PD的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明首烏方在改善L-DOPA藥代動(dòng)力學(xué)過程的同時(shí),增高紋狀體細(xì)胞外液D