白芍原植物遺傳多樣性的rapd分析

白芍原植物遺傳多樣性的rapd分析

白芍是中國著名的傳統(tǒng)中醫(yī)。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2000年版），其植物來源為雷托科植物納羅西亞斯托納（paeonalosi亞斯托納）。我國的白芍歷來有3大傳統(tǒng)品種,即產(chǎn)區(qū)為安徽亳州的亳白芍、浙江東陽等地的杭白芍以及四川中江等地的川白芍,另外在山東、陜西、江蘇和河南等地也有白芍產(chǎn)出。對于其原植物,金昌東等認(rèn)為,我國白芍原植物主要來源于芍藥的變種毛果芍藥[P.lactifloraPall.var.trichocarpa(Bunge)Stern]。作者2001年在白芍花期對安徽亳州、浙江東陽、四川中江、山東菏澤、陜西韓城和江蘇東海等地進(jìn)行了實地調(diào)查、標(biāo)本及活植物采集,結(jié)果表明:我國白芍主產(chǎn)地的原植物為芍藥及毛果芍藥,同時每個產(chǎn)地的各個即原植物居群有穩(wěn)定的種內(nèi)變異類型(另文發(fā)表)。從目前的情況看,白芍的種質(zhì)有的為原產(chǎn)地道地;有的是不同時期的引種品;有的是同地不同種;有的基本上還是野生植物,因此原植物種的分類界定比較混亂,遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)也有較大程度的變異。應(yīng)用分子生物學(xué)的方法對芍藥屬進(jìn)行系統(tǒng)分類已有多篇報道,但主要為種間關(guān)系的討論。周紅濤等應(yīng)用RAPD的方法對11個居群的43個單株的芍藥進(jìn)行居群間遺傳分化的研究,但實驗將43株芍藥都視同1種,未涉及到以花色為特征的明顯的種內(nèi)變異。PAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)方法是運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理,以隨機設(shè)計的寡核苷酸引物擴增總DNA的一些片段、檢測核苷酸變異的一種方法,近年來這種方法已被廣泛應(yīng)用于植物種內(nèi)不同居群間親緣關(guān)系的研究。本項目應(yīng)用PAPD方法對中國白芍較有代表性的10個原植物居群進(jìn)行比較研究,以探討白芍種質(zhì)各居群間的變異程度及親緣關(guān)系,達(dá)到種質(zhì)整理的目的,并結(jié)合其有效成分的含量、染色體核型(另文發(fā)表)等實驗,試圖對中國傳統(tǒng)中藥白芍的原植物種質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。1材料和方法1.1種植物生長栽培所用實驗材料見表1。陜西韓城材料為1999年11月引種,其余均為2001年5月引種,種植于江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所種質(zhì)圃內(nèi)。經(jīng)王希蕖高工、杭悅宇研究員和陳丙鑾鑒定,憑證標(biāo)本存于江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館(NAS)。1.2pcr檢測dna參照Rogers等用CTAB法提取總DNA,本文進(jìn)行了方法優(yōu)化,其步驟為:嫩葉片(去粗葉脈,約3～4g)→加液N2研磨成細(xì)粉→加1倍體積的預(yù)熱為65℃的2×CTAB提取液[CTAB2%,Tris-HCl(pH8.0)0.1mol/L,NaCl1.4mol/L,EDTA(pH8.0)20mmol/L,PVP2%,β-巰基乙醇1%]→65℃保溫1h→加等體積的氯仿-異戊醇[V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1]于搖床上振搖1h,使混勻→10000r/min室溫下離心10min→取上清液→加3/2倍體積異丙醇→靜置→鉤出沉淀用70%乙醇洗滌(如色素多則于搖床上振搖洗滌)→沉淀揮干酒精后溶于適量的TE緩沖液中→加適量(10mg/mL)的RNase于37℃處理30～60min→加等體積的氯仿-異戊醇[V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)輕柔混勻→11500r/min15℃離心10min→取上清液,加1/10體積3mol/LNaAc和2倍體積預(yù)冷(-20℃)的無水乙醇→鉤出DNA→70%乙醇洗滌→倒凈乙醇→揮干酒精后溶于適量的TE緩沖液中→4℃?zhèn)溆?。所得DNA于0.8%瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行檢測,電泳緩沖液為1×TAE?？傮w積為25μL,其中水14.3μL,10×PCRBuffer2.5μL,25mmol/LMgCl21.5μL,2.5mmol/LdNTP2μL,5U/μLTaq酶0.2μL,10ng/μL的引物1.5μl,25ng/μLDNA溶液3.0μL。擴增程序為94℃預(yù)變性3min后,45個循環(huán):94.5℃變性45s,35.6℃復(fù)性1min,72℃延伸2min,最后1個循環(huán)完成之后,72℃再延伸7min,冷卻至10℃取出,用1.4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。電泳圖譜中的每1條帶(DNA片段)均為1個分子標(biāo)記(Marker),并代表1個引物結(jié)合點。根據(jù)各分子標(biāo)記的有無及其遷移率統(tǒng)計得到所有位點的二元數(shù)據(jù),無帶記為0,有帶記為1,用NTSY-PC軟件中Dice的方法計算樣品間的遺傳相似系數(shù),并畫出聚類圖。2結(jié)果2.1rapd的正式實驗選取DNA樣本,試用上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的92個引物,選擴增條帶信號強,背景干凈的40個引物做RAPD的正式實驗(見表2)。2.2引物和遺傳多樣性分析40個隨機引物對白芍10個居群59個個體進(jìn)行擴增,共擴增出242個片段,平均每個引物6.05個片段,其中154個片段具多態(tài)(占63.64%)(圖1),說明白芍的栽培居群間保存著豐富的遺傳多樣性。2.3花居群與其他居群的遺傳距離根據(jù)擴增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,計算Nei&Li相似系數(shù)(相似系數(shù)矩陣見表3),并得聚類圖(見圖2)。據(jù)聚類圖可知:本實驗所分析的10個居群中陜西韓城紅花居群與亳白芍蒲棒居群間的遺傳相似系數(shù)最大(0.888),江蘇東海紅花居群與亳白芍紅花居群的遺傳距離較遠(yuǎn),菏澤居群與其他居群的遺傳距離最遠(yuǎn)。據(jù)鐘揚等計算結(jié)合線的方法:把每次聚合的水平值UK排列后,求出ΔUK=UK+1-UK,發(fā)現(xiàn)最大的ΔUK值(此處為1次跳變),則結(jié)合線取在該跳變值的中點:L=(UK+1+UK)/2。本實驗的結(jié)合線為:L=(0.824+0.771)/2=0.7975。由結(jié)合線L=0.7975可將白芍原植物10個居群劃分為6組:第一組包括杭白芍白花和粉紅花居群(毛果芍藥);第二組為東海居群(芍藥);第三組原植物均為芍藥,包括韓城居群、亳白芍蒲棒居群、亳白芍線條居群和川白芍粉紅花居群;第四組為川白芍白花居群(毛果芍藥);第五組為杭白芍紅花居群(毛果芍藥);第六組為菏澤居群(芍藥)。3討論3.1群間遺傳多樣性初步評估用RAPD的分子標(biāo)記對我國主要栽培白芍原植物各居群間遺傳多樣性初步評估,多態(tài)率達(dá)63.64%,證明在現(xiàn)有的主要栽培白芍原植物中存在較豐富的遺傳多樣性,這些遺傳變異構(gòu)成了選育白芍優(yōu)良品種的物質(zhì)基礎(chǔ)。3.2原植物與原樹種間的遺傳距離按照聚類圖的結(jié)果,原植物為芍藥的居群主要集中在第3組,即為近于野生的韓城居群和相近的亳白芍2個品種居群和川白芍粉紅花居群,他們的花色為紅色系列(川白芍為粉紅花),后3個居群均為白芍主品種,在栽培地的野生轉(zhuǎn)家化歷史已經(jīng)達(dá)數(shù)百年。這個聚類結(jié)果顯示了作為一個種在遺傳關(guān)系上的相似,由于川白芍花色有變、同時雄蕊有明顯的部分瓣化,盡管遺傳表達(dá)不會受生態(tài)環(huán)境即分布區(qū)域的影響,但是產(chǎn)生了突變和表達(dá)選擇,因此顯示了川白芍與野生種在本組內(nèi)有較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系。亳州的2個居群盡管品種不同,但是顯示了最為接近的遺傳關(guān)系,說明地域性對同種植物的遺傳關(guān)系同樣有重要意義。原植物同樣是芍藥的東海居群(第2組)和菏澤居群(第6組)顯示了相對獨立的遺傳關(guān)系。據(jù)調(diào)查,東海居群樣本是40多年前從安徽亳州引進(jìn),但聚類結(jié)果與目前亳州栽培的白芍顯示了較遠(yuǎn)的遺傳距離,因此,對這一組的分析就存在了一些疑問,原因可能為二:一是目前東海的居群經(jīng)過40多年的栽培管理,出現(xiàn)記錄誤差;二是亳州目前的栽培種質(zhì)與40年前的栽培種質(zhì)不盡相同,因此,對這一組的分析不能妄下結(jié)論。荷澤居群與原變種相比植物外部形態(tài)發(fā)生了很大的變異,即雄蕊全部瓣化,菏澤不僅是藥用白芍的產(chǎn)地也是觀賞芍藥的產(chǎn)地,盡管本實驗所采樣品取自于用作藥用的白芍,但由于雄蕊瓣化是觀賞植物品種突變體篩選的一個途徑,因此菏澤的藥用白芍種質(zhì)可能來自于觀賞芍藥突變體品種,與其他原植物為芍藥的居群有一定的遺傳距離就不難解釋了。原植物為毛果芍藥的4個居群中,杭白芍粉紅花居群和白花居群獨立成一組(第1組),這與形態(tài)分類的結(jié)果一致。杭白芍的另一個紅花居群另成一組(第5組),這個結(jié)果與染色體C-帶的實驗結(jié)果一致(另文發(fā)表),同時杭白芍紅花居群盡管獨立成組,但和川白芍白花居群及芍藥居群關(guān)系較近,提供了作為種及變種的一個認(rèn)定依據(jù)。3.3新種形態(tài)特征的可能和進(jìn)一步研究從上述實驗結(jié)果可看出:芍藥及其變種毛果芍藥的遺傳關(guān)系非常近而且有交叉。毛果芍藥的分類界定依據(jù)是形態(tài)特征,與原變種相比,心皮被毛。但根據(jù)作者的研究和觀察,芍藥(或毛果芍藥)作為一