莖尖微嫁接技術(shù)在無病木培養(yǎng)中的應(yīng)用

莖尖微嫁接技術(shù)在無病木培養(yǎng)中的應(yīng)用

佛手柑科。var.sacodiciii已經(jīng)是廣州科的一種柑橘植物。這種干燥的水果通常是具有益肝、理氣、胃痛的常用中藥。佛手在我國栽培歷史悠久,為廣東道地藥材“十大廣藥”之一。佛手在生產(chǎn)中面臨黃龍病的危害,黃龍病是由類細(xì)菌Liberobacterasiaticum引起的毀滅性和傳染性病害,主要通過木虱轉(zhuǎn)移吸食和帶病苗木、接穗等繁殖材料傳播。發(fā)病初期,新抽出的枝梢,其葉片不能正常轉(zhuǎn)綠,表現(xiàn)斑駁或均勻黃化癥狀,直至全株枯黃死亡,且迅速蔓延,目前對病害本身還無有效的防治手段。而且,佛手生產(chǎn)上采用扦插和嫁接繁殖,長期的無性繁殖,病原體逐代傳遞和積累,造成植株長勢減弱、生活力下降、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降,嚴(yán)重威脅佛手的生產(chǎn)和藥材質(zhì)量。佛手產(chǎn)區(qū)的擴(kuò)大,使得接穗和苗木在不同地區(qū)間傳送,又加劇了病害的擴(kuò)散和蔓延。因此,運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)培育脫病原體苗,已成為佛手生產(chǎn)中極為迫切的問題。莖尖微嫁接技術(shù)可以脫除病原體,已在柑桔、沙田柚上獲得成功,并逐步在生產(chǎn)上應(yīng)用。本文采用莖尖微嫁接技術(shù)脫除佛手病原體,并應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對其進(jìn)行黃龍病病原檢測,以建立行之有效的病原檢測方法,從而為佛手品種復(fù)壯和種質(zhì)資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。1材料、機(jī)器和試劑1.1黃自生苗,生苗感染黃龍病的佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle,來源于廣東省肇慶地區(qū),通過電鏡和PCR檢測證明感染了黃龍病病原;砧木為檸檬Citruslimon(Linn.)Burm.f.C.medica.var.limonLinn.實生苗;感染黃龍病的甜橙(采自廣州市羅崗鎮(zhèn));健康一年生檸檬實生苗(采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥圃)。以上材料的原植物均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室張丹雁教授鑒定。1.2pcr檢測方法PCR儀(AppliedBiosystems2720Thermalcycler);UVPGDS7600型凝膠成像儀;TECANSpectraFLUORplus多功能酶標(biāo)儀;SK2492型PCR擴(kuò)增試劑盒及引物(加拿大Sangon獨資上海分公司);3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒;DNAMarker(200bpDNALadderplus)。2方法2.1莖尖微移植2.1.1養(yǎng)基、養(yǎng)基、培養(yǎng)條件取成熟檸檬果實中的種子,經(jīng)表面消毒,剝?nèi)シN皮,接種于MS培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28℃;采摘2～3cm長的佛手病株嫩芽,切取0.5～1cm莖尖,經(jīng)常規(guī)消毒后,在雙目顯微鏡下剝?nèi)〖s0.2mm的莖尖作為接穗。2.1.2插裝法提取“t”字在無菌條件下,將砧木苗從培養(yǎng)瓶中移出,切去部分過長的根并去頂,在雙目顯微鏡下,用自制的解剖刀在上胚軸上切成倒“T”字形切口,將莖尖接到砧木的倒“T”字形切口上,外纏parafilm膜。2.1.3附加6-ba將嫁接苗移入帶濾紙橋的液體培養(yǎng)基中,以MS為基本培養(yǎng)基,附加6-BA0.1mg·L-1和7.5%的蔗糖;培養(yǎng)溫度為25±1℃,每d光照12h,光照強(qiáng)度為2kLx。觀察嫁接苗的長勢,45d后記錄嫁接成活率。2.1.4采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對計量資料進(jìn)行方差分析,比較采用LSD法。2.2龍慶病抗病性2.2.1pcr檢測dna分離效果采用3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒分別提取各樣品總DNA。將提取到的DNA用純水稀釋10倍后,用酶標(biāo)儀分別測定其在260nm、280nm處的吸收值,計算出OD260與OD280的比值及DNA濃度,并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果的優(yōu)劣。2.2.2pcr檢測結(jié)果采用3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取樣品總DNA,紫外分光度法檢測DNA純度和濃度,并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果。根據(jù)法國Villechanoux教授發(fā)表的黃龍病部分DNA序列(基因序號碼為M94319)設(shè)計引物。引物P1(TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGAG)與黃龍病DNA序列的37～60位核苷酸同源;引物P2(ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG)與462～485位核苷酸互補(bǔ),PCR產(chǎn)物的分子量為570bp。2.2.3pcr檢測taq酶2.55反應(yīng)體系為1O×buffer緩沖液5μL,dNTPs5μL(2mmol/L),MgCl23μL(25mmol/L),Taq酶0.5μL(5u/μL),引物各0.5μL(30μmol/L),DNA模板100ng,加入滅菌純水至50μL。循環(huán)參數(shù)為94℃5min,隨后94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,35個循環(huán),最后72℃延伸10min。反應(yīng)完畢后,取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后在凝膠分子成像儀上檢測并拍照記錄。3結(jié)果與分析3.1莖尖微嫁接苗的萌發(fā)在無菌條件下,將砧木苗從培養(yǎng)瓶中移出,切去部分過長的根,并去頂,在雙目顯微鏡下,將切好的莖尖嫁接到砧木上胚軸的倒“T”字形切口上,外纏parafilm膜,再將整株移入帶濾紙橋的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一周后,接穗和上胚軸切口處產(chǎn)生愈傷組織,嫁接苗開始成活。這時要及時除去砧木上長出的不定芽以減少對接穗萌發(fā)的影響;兩周后,接穗開始萌生新葉,砧木也長出少量白色、幼嫩的新根;45d后,莖尖微嫁接苗長出6～8片真葉,見圖1A。此時,將其從培養(yǎng)室中移出,在室內(nèi)自然光下培養(yǎng)3d,取出用蒸餾水洗凈,單株移入混合土壤(50%的營養(yǎng)土:50%細(xì)砂)的營養(yǎng)缽中,注意植株的保濕。一個月后,莖尖微嫁接成活苗可以長出10片左右新葉,見圖1B。3.2生物量檢測在98株微嫁接成活苗中隨機(jī)選取10株進(jìn)行黃龍病病原PCR檢測,以感染黃龍病的甜橙葉片作為正對照,健康一年生檸檬實生苗作為負(fù)對照,同時檢測表現(xiàn)黃龍病癥狀的佛手葉片。結(jié)果表明:感染了黃龍病病原的甜橙及表現(xiàn)黃龍病癥狀的佛手,在預(yù)計的570bp擴(kuò)增出特異的電泳譜帶,而健康檸檬實生苗及佛手莖尖微嫁接苗均未擴(kuò)增出特征譜帶,表明佛手的感病癥狀是由黃龍病病原引起的,莖尖微嫁接技術(shù)可以脫除佛手黃龍病病原。見圖2。3.3苗木、接穗愈傷組織的影響在上述試驗中發(fā)現(xiàn),切取約0.2mm(帶2個葉原基)的莖尖進(jìn)行嫁接,所獲得的嫁接苗全部脫除病原體,但嫁接成活率低,難以滿足生產(chǎn)需要。通常認(rèn)為,莖尖越大,嫁接成活率越高,但帶病原體的幾率也越大。本實驗對不同大小的莖尖:無葉原基、帶2個葉原基、帶4個葉原基及帶6個葉原基,分別進(jìn)行微嫁接試驗。觀察嫁接后傷口的變化,7d后產(chǎn)生少量的愈傷組織,10d后愈傷組織可達(dá)到最多,砧木愈傷組織前期并不比莖尖生長快,但10d后,由于根系能不斷供給水分和營養(yǎng),砧木愈傷組織能夠?qū)⒖障逗芸焯顫M,當(dāng)砧木愈傷組織和接穗愈傷組織連接后,細(xì)胞之間通過胞間連絲使水分和營養(yǎng)物質(zhì)溝通。此后,雙方進(jìn)一步分化出新的形成層,并能形成新的木質(zhì)部和韌皮部,使接穗和砧木之間運(yùn)輸水分與營養(yǎng)物質(zhì)的輸導(dǎo)組織貫通,這樣,便形成了一個新的整體。雙方愈傷組織形成越多,嫁接成活率就越高。因此,嫁接成活的關(guān)鍵是砧木和接穗能否長出足夠的愈傷組織。由表1可以看出,莖尖大小直接影響嫁接成活率,帶2、4、6個葉原基能明顯提高嫁接成活率(P<0.01),帶4個葉原基的莖尖嫁接成活率最高,達(dá)60.00%,與帶6個葉原基的莖尖嫁接成活率存在明顯差異(P<0.05);6個葉原基的莖尖嫁接成活率有所降低,這可能是因為砧木接口較細(xì),莖尖大時,造成砧木裂口較大,砧木和莖尖的愈傷組織不能很快將空隙填滿,所以兩者不易愈合;無葉原基的莖尖嫁接后,一般在1～3d內(nèi)就變褐、死亡,可能是因為僅有生長錐,活力有所下降,形成的愈傷組織少,同時剝?nèi)〔僮鲿r間較長,分生組織細(xì)胞有一定損傷。砧木上產(chǎn)生的不定芽數(shù)和不定芽的長度也和嫁接成活率密切相關(guān),嫁接成活率越高,產(chǎn)生的不定芽數(shù)和不定芽長度就越小,這可能是因為接穗成活后會通過砧木吸收營養(yǎng),從而抑制了砧木上不定芽的生長。3.4莖尖大小對脫db的影響進(jìn)行莖尖微嫁接時,切取莖尖越小,帶有病原體的可能性就越小。在上述試驗中,以帶2個葉原基、4個葉原基及6個葉原基的莖尖為接穗,分別獲得了嫁接成活苗?，F(xiàn)采用PCR技術(shù)分別對其進(jìn)行黃龍病病原的檢測,考察莖尖大小對脫除病原體效果的影響,結(jié)果見圖3。以帶2個葉原基的莖尖嫁接獲得的成活苗,脫病原體率為100%;帶4個葉原基的莖尖微嫁接苗,脫病原體率可達(dá)85.71%。隨著莖尖增大,脫病原體率明顯下降。根據(jù)Navarro等在柑桔上的研究證明,只有小于0.2mm(約2個葉原基)的莖尖是完全不帶病原體的。本研究也表明,帶2個葉原基的莖尖脫病原體率為100%,但嫁接成活率較低,僅為21.67%。因此,綜合考慮嫁接成活率及脫病原體的效果,宜選用帶3～4個葉原基的莖尖來進(jìn)行脫病原體苗的生產(chǎn)。4莖尖的微嫁接佛手病害較為嚴(yán)重,黃龍病是由類細(xì)菌(類菌原體)侵染所致,以木虱作為傳播媒介,是一種毀滅性的病害,目前尚無有效的防治措施。因此,無病苗木的培育對生產(chǎn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的佛手藥材具有重要意義。莖尖微嫁接技術(shù)可以脫除植物的各種病原體,而且既不會產(chǎn)生變異,也無童期現(xiàn)象,因此已成為獲得柑桔屬植物無病原體苗木的最佳途徑。由于引起病害的微生物在植物體內(nèi)的活動主要是通過植物的輸導(dǎo)組織,而莖尖的分生組織并未形成輸導(dǎo)組織,加上頂端分生組織細(xì)胞分裂速度快,所以通過莖尖微嫁接可以獲得脫病原體苗。莖尖大小對嫁接成活率和脫病原體率的影響較大,取材過小,雖然脫病原體效果好,但是剝離和培養(yǎng)成活很困難取材過大往往影響脫病原體效果。本研究表明,帶2個葉原基的莖尖,完全不帶病原體,但嫁接成活率低。綜合考慮嫁接成活率及脫病原體的效果,可以選用帶3～4個葉原基的莖尖來進(jìn)行脫病原體苗的生產(chǎn)。黃龍病病原細(xì)菌分為兩個株系:亞洲株系和非洲株系,目前在我國發(fā)現(xiàn)的均為黃龍病原亞洲株系,法國Villechanoux教授發(fā)表了黃龍病(L