甘薯莖尖組織培養(yǎng)研究

甘薯莖尖組織培養(yǎng)研究

重慶是中國的主要甘薯產(chǎn)區(qū)之一。它的種植面積和產(chǎn)量分別為中國的三倍和四級(jí)。甘薯已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的主要產(chǎn)業(yè)。甘薯由于受病毒侵染導(dǎo)致種性退化,使優(yōu)良品種的育種特性無法得到全部展現(xiàn),直接影響到單產(chǎn)和品質(zhì),嚴(yán)重阻礙了良種推廣和大面積生產(chǎn)。目前,采用莖尖脫毒是恢復(fù)品種育種特性,防止或減少因病毒感染造成損失的最有效途徑。本文通過對(duì)當(dāng)前重慶市主推的高淀粉專用品種‘渝薯2號(hào)’進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)效果的研究,進(jìn)一步探討高淀粉品種莖尖組織培養(yǎng)的方法,以期能夠提高品種脫毒率和成苗率。1材料和方法1.1材料表面試驗(yàn)選用高淀粉品種‘渝薯2號(hào)’作為供試材料。1.2方法1.2.1不同方法消毒微莖尖培養(yǎng)大田選取生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的健康植株,剪取3cm左右長(zhǎng)的頂芽,將其用0.1%洗衣粉液浸泡10min,流水沖洗1~2h后,采用不同方法消毒:(1)用2.5%NaOCl水溶液或0.1%生汞一次浸泡消毒;(2)先用75%酒精浸泡60s,再用2.5%NaOCl或0.1%升汞消毒5~10min。之后用無菌水沖洗5次,切取合適的微莖尖,置于添加篩選的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。5d后統(tǒng)計(jì)污染數(shù);培養(yǎng)70d,統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)、成苗數(shù)。計(jì)算污染率、死亡率、成苗率,篩選最佳消毒方法。1.2.2因素4個(gè)不同的處理使用正交設(shè)計(jì)的方法篩選最優(yōu)不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比。取3個(gè)因素:BA、NAA、GA3,每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平(BA0.5、1.0、2.0mg/L,NAA0.05、0.1、0.2mg/L,GA30.05、0.50、1.00mg/L),共9個(gè)處理。培養(yǎng)70d觀察成苗率及芽的生長(zhǎng)表現(xiàn)。1.2.3葉原基、莖尖在培養(yǎng)方基中的篩選取渝薯2號(hào)帶病毒植株的芽,消毒后剝離帶1個(gè)葉原基(0.1~0.2mm)、帶2個(gè)葉原基(0.3~0.4mm)、帶3個(gè)葉原基(0.6~0.7mm)的莖尖接種于篩選的培養(yǎng)基上培養(yǎng)70d,統(tǒng)計(jì)脫毒率、成苗率、單莖尖芽數(shù)。1.2.4培養(yǎng)二次培養(yǎng)基采用一次培養(yǎng)及二次培養(yǎng)2種培養(yǎng)方式。一次培養(yǎng)即始終在篩選的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上培養(yǎng);二次培養(yǎng)即在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d左右,待莖尖分生組織膨大變綠后,轉(zhuǎn)到1/2MS無生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)70d后統(tǒng)計(jì)成苗率、單莖尖芽數(shù)、平均株高。1.2.5添加蔗糖、瓊脂粉培養(yǎng)基配制:不同培養(yǎng)基按試驗(yàn)要求添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或其他成分;每升MS培養(yǎng)基中加入30g蔗糖、8g瓊脂粉,pH=5.8。培養(yǎng)條件:T=(28±2)℃;光照時(shí)間16h/d;光照強(qiáng)度2000~3000lx。2結(jié)果與分析2.1不同方法使用一步法,污染率高,死亡率低,成苗率高。c組不同消毒方法條件下,莖尖的污染率、死亡率和成苗率有明顯的差異。A組使用兩步法,污染率最低,但死亡率卻顯著上升;B組使用一步法,污染率較低,死亡率最低,成苗率超過76%;C組也使用一步法,但污染率最高,說明NaOCl的消毒效果次于升汞。試驗(yàn)結(jié)果表明,處理5(0.1%升汞的溶液消毒7~8min)的污染率、死亡率低,成苗率達(dá)到85%(見表1)。2.2渝薯2號(hào)莖尖分生組織的培養(yǎng)順序根據(jù)正交設(shè)計(jì)法,某因子不同水平的極差越大,說明該因子對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。從正交試驗(yàn)的結(jié)果(表2)可以看出,3個(gè)因子對(duì)渝薯2號(hào)莖尖分生組織培養(yǎng)的影響順序由大到小為NAA>GA3>BA。根據(jù)某因素kj值大小確定該因子的最好水平,可知BA最好水平為1.0mg/L、NAA最好水平為0.05mg/L、GA3最好水平為0.5mg/L。2.3再生植株的培養(yǎng)在篩選的培養(yǎng)基上,由不同大小莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織,其生長(zhǎng)速度、成苗率和脫毒率有明顯差異。從表3可以看出,帶1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)葉原基的莖尖的成苗率分別為55.3%、75.8%、81.5%,可見隨著外植體所帶葉原基數(shù)目的增多,培養(yǎng)出再生植株就越容易。在培養(yǎng)過程中,帶1個(gè)葉原基的莖尖表現(xiàn)出愈傷組織形成慢、根和葉分化慢、單莖尖芽數(shù)少(1.2個(gè)),比帶2個(gè)、3個(gè)葉原基的莖尖少0.6和0.9個(gè)。帶3個(gè)葉原基的莖尖成苗率較高,但脫毒率顯著下降,只有35.5%,顯然,莖尖越大,脫毒效果越差。試驗(yàn)結(jié)果表明,大小0.3~0.4mm、帶2個(gè)葉原基的莖尖,在成苗率、脫毒率和單莖尖芽數(shù)3個(gè)方面綜合表現(xiàn)最好。2.4次培養(yǎng)與自然株高、成苗率、單莖尖芽數(shù)的變化不同的培養(yǎng)方式對(duì)莖尖分生組織培養(yǎng)的影響有差異。采用一次培養(yǎng)平均株高與二次培養(yǎng)相比差異不大,但成苗率高15.7個(gè)百分點(diǎn),單莖尖芽數(shù)增加0.2個(gè)(表4)。在莖尖分生組織培養(yǎng)中,成苗率是關(guān)鍵因素,因此使用一次培養(yǎng)比二次培養(yǎng)效果更好。3討論3.1外植體消毒時(shí)間正確選擇消毒劑及濃度,嚴(yán)格把握消毒時(shí)間是取得良好消毒效果的關(guān)鍵。升汞可使蛋白質(zhì)變性,對(duì)細(xì)菌的殺死能力很強(qiáng),在組織培養(yǎng)中,細(xì)菌比真菌去除難度大,用升汞進(jìn)行外植體消毒效果更好。污染率與消毒時(shí)間成反比,死亡率與消毒時(shí)間成正比,過高的污染率和死亡率均會(huì)使消毒環(huán)節(jié)成為無用功,確定消毒時(shí)間要綜合考慮這2個(gè)因素。二步法消毒過程中,酒精主要消殺外植體表面和增加外植體表面透性,使第2種消毒劑更易于進(jìn)入外植體組織內(nèi)部殺菌。甘薯是草本植物,表皮柔嫩,酒精的使用使升汞進(jìn)入外植體內(nèi)部的劑量過多,導(dǎo)致死亡率大幅上升。3.2實(shí)行切取莖尖小組景外植體質(zhì)量、莖尖大小和病毒種類是莖尖脫毒效果的主要影響因子。莖尖越小,去除病毒的可能性越大,但培養(yǎng)難度也越大。實(shí)際操作中,如果切取莖尖太小,不帶、少帶或帶葉原基不完整,成活率很低,就失去了實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。為了保證成苗和脫毒,可結(jié)合田間株選,選取長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、沒有病害癥狀的薯苗,結(jié)合熱處理,剝?nèi)?.3~0.4mm、帶2個(gè)葉原基的莖尖,成苗后再對(duì)植株反復(fù)切取0.4mm以下的莖尖培養(yǎng),能有效去除病毒。3.3葉原基的生長(zhǎng)莖尖越大,成活率越高,但病毒越難去除。葉原基是莖尖成活的必要條件,只帶1個(gè)葉原基的莖尖成苗較難,一般帶2個(gè)葉原基,絕大多數(shù)品種能夠培養(yǎng)出再生植株。有些報(bào)道中主張以莖尖的絕對(duì)長(zhǎng)度作為莖尖適宜長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn),但不同基因型、不同栽培條件、不同部位的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)大小差異較大,因此,這樣的標(biāo)準(zhǔn)是不準(zhǔn)確的。3.4基因型莖尖的生長(zhǎng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、配比和濃度對(duì)莖尖分化成苗具有重要作用,尤以生長(zhǎng)素最為突出。一般來說,少量的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)有利于莖尖的成活,常用的有6-BA,濃度為0.5~1.0mg/L;生長(zhǎng)素中常用的有IAA和NAA,濃度范圍為0.1~1.0mg/L。唐君等(2001)認(rèn)為不同基因型莖尖對(duì)培養(yǎng)基有較強(qiáng)的選擇性李強(qiáng)(2001)認(rèn)為在一定范圍內(nèi),BA有促進(jìn)愈傷組織發(fā)生和芽分化的作用;對(duì)于不易誘導(dǎo)材料,BA適宜濃度為4.0mg/L;對(duì)于易誘導(dǎo)材料,BA濃度以2.0mg/L為宜;龔一富、高峰(1999)則認(rèn)為0.5mg/LBA是愈傷組織生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基。本試驗(yàn)結(jié)果表明,“MS+1.0mg/LBA+0