福州市朱槿曲葉病流行的調(diào)查

福州市朱槿曲葉病流行的調(diào)查

cotolite的針頭感染是世界上最毀滅性的棉花感染。它在巴基斯坦、印度、蘇聯(lián)、埃及、南非和其他國(guó)家的棉花主產(chǎn)區(qū)非常流行。僅從1992年到1997年，巴基斯坦經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)50億人民幣。棉花曲葉病是多種雙生病毒引起,這些雙生病毒都屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)成員,皆由煙粉虱[Bemisiatabaci(Genn.)]以持久方式傳播,也可以嫁接傳播,但不能通過(guò)機(jī)械摩擦接種傳播和種子帶毒傳播;其基因組僅含有DNA-A組分,并伴隨衛(wèi)星β分子。鑒于棉花曲葉病的危害性,2007年5月28日正式發(fā)布實(shí)施的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中,再次將其列入植物檢疫對(duì)象。盡管如此,棉花曲葉病的主要病原之一,木爾坦棉花曲葉病毒,還是很快在我國(guó)朱槿(Hibiscusrosa-sinensisLinn.)植物上被發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)不到8年的擴(kuò)散,該病毒已經(jīng)在我國(guó)廣東、廣西、海南等省多個(gè)地理區(qū)域的多種植物上流行危害,其他省市,包括我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉花產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)棉花曲葉病。因此,密切監(jiān)視和防控CLCuMV引起的病害擴(kuò)散是各級(jí)植保植檢部門和科研工作者的重要任務(wù)。2011-2012年,實(shí)驗(yàn)室科研人員先后于福建省廈門、福州、寧德等市公路綠化帶發(fā)現(xiàn)朱槿曲葉病疑似病株,并詳細(xì)調(diào)查了該病在福州市的發(fā)生情況。經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)福州市城市道路、公園、工廠、學(xué)校、政府機(jī)關(guān)等多數(shù)存在朱槿植物的綠化帶以及位于市郊的絕大多數(shù)苗圃基地皆存在疑似病株,經(jīng)過(guò)分子檢測(cè)和序列比較,證實(shí)該病害病原為木爾坦棉花曲葉病毒,傳毒介體為B型煙粉虱,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料和方法1.1麻花葉病毒病株鑒定植物樣品:朱槿曲葉病疑似病株葉片和健株葉片采集于福州市郊區(qū)苗圃基地,液氮速凍后保存于-70℃超低溫冰箱中備用,陽(yáng)性對(duì)照樣品為已經(jīng)鑒定的苧麻花葉病毒病病株。介體昆蟲:煙粉虱種群分別采自福州市郊區(qū)朱槿健株和疑似病株以及煙草上,收集于含75%乙醇的1.5mL離心管中,保存于-70℃超低溫冰箱或-20℃冰箱中備用。1.2朱槲曲葉病的發(fā)生時(shí)間和可能輸入途徑調(diào)查福州市種植朱槿的公園、道路、單位和苗圃基地,走訪苗圃基地花農(nóng),記錄朱槿曲葉病的發(fā)生時(shí)間和可能的傳入途徑;對(duì)照健康植株,觀察發(fā)病朱槿植株葉片是否畸形和黃化,葉片大小是否變化,葉背有無(wú)耳突,葉脈是否增厚等,植株是否矮化等。1.3數(shù)據(jù)處理與pcr采用周雪平等報(bào)道的CTAB提取法提取朱槿葉片中的總DNA(總共有14份植物樣品,包括病葉樣品12份、健葉樣品1份,對(duì)照樣品1份)。煙粉虱生物型的鑒定使用多頭昆蟲(30～50頭)提取的DNA,方法如下:將煙粉虱置于1.5mL離心管中,液氮速凍后,用研磨棒研磨成粉狀,加入含200μL堿裂解液(50mmol/LTris-HCl,pH8.0,20mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,1%SDS)和1μL蛋白酶K(終濃度1μg/mL),55℃水浴鍋中水浴2～3h;離心(12000r/min,下同)5min后取上清,加入200μL24∶1的氯仿/異戊醇抽提,重復(fù)1次;離心5min后取上清,加入等體積的異丙醇,-20℃放置20min;離心10min,去上清,沉淀用70%乙醇洗1次,然后將DNA沉淀室溫晾干,加入60μLddH2O溶解后即可用于PCR反應(yīng)。煙粉虱帶毒率監(jiān)測(cè)使用朱槿曲葉病病株上采集的煙粉虱,單頭煙粉虱總DNA的提取方法參照潘慧鵬等。1.4pcr檢測(cè)多種病毒引物的試驗(yàn)利用Shatters等基于B型和Q型煙粉虱mtDNACOⅠ基因片段設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增特異性引物來(lái)鑒定煙粉虱的生物型是B型還是Q型;利用謝艷等設(shè)計(jì)的雙生病毒通用引物來(lái)檢測(cè)福州朱槿曲葉病是否由雙生病毒引起,并在序列分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA-A余下片段的引物。PCR熱循環(huán)程序?yàn)?94℃4min,94℃20s,55℃20s,72℃30s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖(0.5×TBE)電泳檢測(cè),BioRad凝膠成像儀觀察,記錄結(jié)果。1.5材料和測(cè)序雙生病毒通用引物PCR擴(kuò)增所得的檢測(cè)片段連接pMD18-T(TaKaRa),轉(zhuǎn)化克隆驗(yàn)證后委托南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。運(yùn)用DNAMAN軟件(LynnonBiosoftInc.)對(duì)所獲序列進(jìn)行加工整理和同源性分析。2結(jié)果與分析2.1朱槲曲葉病擴(kuò)散傳播通過(guò)與苗圃基地花農(nóng)們座談得知,福州朱槿苗木最初由廣東調(diào)運(yùn)而來(lái),隨后經(jīng)過(guò)枝條扦插繁殖而擴(kuò)大種植;朱槿疑似曲葉病最早發(fā)生于2009年,當(dāng)時(shí)只有零星苗圃發(fā)生,經(jīng)過(guò)3年時(shí)間已經(jīng)擴(kuò)散至福州市各苗圃基地、多數(shù)綠化帶以及周邊縣市。因此,推測(cè)該病隨苗木調(diào)運(yùn)而傳入福州地區(qū)。福州市朱槿曲葉病發(fā)病癥狀和已報(bào)道的朱槿曲葉病癥狀一致,如封面所示:發(fā)病朱槿植株和枝條都明顯矮化;新葉黃化明顯;葉片畸形,變小,老葉和新葉皆向上卷曲,呈杯狀或勺狀;葉脈增大、明脈或脈突,葉片背面粗糙不平且于葉脈處產(chǎn)生耳突;較大的朱槿病株都能正常開(kāi)花,但花較健康略小,但較小的苗木多數(shù)不能正常開(kāi)花。2.2pcr擴(kuò)增dna應(yīng)用雙生病毒的通用引物(PA/PB)對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,樣品1～12號(hào)都能得到預(yù)期約480bp大小的片段(見(jiàn)圖1)。選擇樣品1～6進(jìn)行測(cè)序,檢測(cè)片段的序列完全一致。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增DNA-A余下約2260bp片段(以樣品1～6的總DNA為模板,擴(kuò)增結(jié)果如圖1中13～18泳道),并予以測(cè)序。DNA-A全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào):JX861210)分析比較如圖2所示,在引起棉花曲葉病的8種病毒中,檢測(cè)樣品的DNA-A序列與CLCuMV相似性最高,其中與CLCuMV廣東分離物(JX286664)和廣西分離物(JQ317603)的相似性高達(dá)99.6%以上,說(shuō)明引起福州朱槿曲葉病的病原是CLCuMV。2.3煙粉病生物b型dna的pcr檢測(cè)煙粉虱生物型鑒定應(yīng)用相應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖3所示,用鑒定B型煙粉虱的特異性引物PCR擴(kuò)增能得到預(yù)期的、約480bp大小的DNA產(chǎn)物(B1～B6),而用鑒定Q型的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,未得到預(yù)期的、約300bp大小的DNA帶條(Q1～Q6),說(shuō)明采集于煙草和健康或發(fā)病朱槿上的煙粉虱生物型是B型。朱槿病株上煙粉虱的帶毒率應(yīng)用引物PA/PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以已經(jīng)鑒定的病株和健株上采集的煙粉虱分別做陽(yáng)性和陰性對(duì)照,結(jié)果如圖4所示。22頭朱槿病株上采集的煙粉虱樣品PCR擴(kuò)增皆能得到預(yù)期的、約480bp大小的DNA條帶,所檢測(cè)的煙粉虱帶毒率100%,說(shuō)明煙粉虱的帶毒效率很高。3主要病毒傳播地區(qū)試驗(yàn)證實(shí)福州市朱槿曲葉病是由CLCuMV侵染引起的。CLCuMV是引起棉花曲葉病的主要病原之一,而棉花曲葉病是棉花生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒病害,多次在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)暴發(fā)流行,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)道從棉花曲葉病樣中檢測(cè)到8種雙生病毒,分別為木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、阿拉巴德棉花曲葉病毒(CottonleafcurlAlabadvirus,CLCuAV)、Kokhran棉花曲葉病毒(CottonleafcurlKokhranvirus,CLCuKV)、番木瓜曲葉病毒(Papayaleafcurlvirus,PaLCuV)、杰濟(jì)拉棉花曲葉病毒(CottonleafcurlGeziravirus,CLCuGV)、拉賈斯坦棉花曲葉病毒(CottonleafcurlRajasthanvirus,CLCuRV)、班加羅爾番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlBangalorevirus,ToLCBV)和布里瓦拉棉花曲葉病毒(CottonleafcurlBurewalavirus,CLCuBuV),這8種病毒在自然條件下由煙粉虱以持久方式傳播,也可以嫁接傳播,不能通過(guò)其他方式傳播,自然寄主包括棉花、黃秋葵、朱槿、垂花懸鈴花和蔟生黃麻等植物。目前,我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉花產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)棉花曲葉病毒危害,但在廣東、廣西、海南3省已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CLCuMV危害朱槿、黃秋葵等植物,危害范圍日益擴(kuò)大。與廣西情況相似,福建的朱槿苗木最初也是主要來(lái)源于廣東,經(jīng)過(guò)若干年的發(fā)展,朱槿已經(jīng)成為城市公路、公園、工廠、學(xué)校、政府機(jī)關(guān)等常用的綠化植物。由于CLCuMV福州分離物DNA-A與廣東分離物的相似性高達(dá)99.6%以上,推測(cè)CLCuMV可能是通過(guò)朱槿的苗木調(diào)運(yùn)而從廣東省入侵福建省的。入侵后的CLCuMV經(jīng)過(guò)B型煙粉虱在苗圃間傳播,同時(shí)病枝扦插繁殖、苗木交易加速了病毒病的發(fā)生和蔓延擴(kuò)散。更為重要的是,朱槿和棉花同屬錦葵科,且我國(guó)廣西已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有CLCuM