炭疽防治技術(shù)規(guī)范

十三、炭疽防治技術(shù)規(guī)范炭疽（Anthrax）是由炭疽芽胞桿菌引發(fā)的一種人畜共患傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。為防止和控制炭疽，根據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》和其它有關(guān)法律法規(guī)，制訂本規(guī)范。1合用范疇本規(guī)范規(guī)定了炭疽的診療、疫情報告、疫情解決、防治方法和控制原則。本規(guī)范合用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事動物喂養(yǎng)、經(jīng)營及其產(chǎn)品的生產(chǎn)、經(jīng)營的單位和個人，以及從事動物防疫活動的單位和個人。2診療根據(jù)本病流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診療成果做出綜合鑒定。2.1流行特點(diǎn)本病為人畜共患傳染病，多個家畜、野生動物及人對本病都有不同程度的易感性。草食動物最易感，另首先是雜食動物，再次是肉食動物，家禽普通不感染。人也易感?；疾游锖鸵蛱烤叶劳龅膭游锸w以及污染的土壤、草地、水、飼料都是本病的重要傳染源，炭疽芽胞對環(huán)境含有很強(qiáng)的抵抗力，其污染的土壤、水源及場地可形成持久的疫源地。本病重要經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚感染。本病呈地方性流行。有一定的季節(jié)性，多發(fā)生在吸血昆蟲多、雨水多、洪水泛濫的季節(jié)。2.2臨床癥狀2.2.1本規(guī)范規(guī)定本病的潛伏期為20天。2.2.2典型癥狀本病重要呈急性通過，多以忽然死亡、天然孔出血、尸僵不全為特性。牛：體溫升高常達(dá)41℃以上，可視黏膜呈暗紫色，心動過速、呼吸困難。呈慢性通過的病牛，在頸、胸前、肩胛、腹下或外陰部常見水腫；皮膚病灶溫度增高，堅硬，有壓痛，也可發(fā)生壞死，有時形成潰瘍；頸部水腫常與咽炎和喉頭水腫相伴發(fā)生，致使呼吸困難加重。急性病例普通經(jīng)24～36小時后死亡，亞急性病例普通經(jīng)2～5天后死亡。馬：體溫升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常見水腫。舌炭疽多見呼吸困難、發(fā)紺；腸炭疽腹痛明顯。急性病例普通經(jīng)24～36小時后死亡，有炭疽癰時，病程可達(dá)3～8天。羊：多體現(xiàn)為最急性（猝死）病癥，搖晃、磨牙、抽搐，掙扎、忽然倒斃，有的可見從天然孔流出帶氣泡的黑紅色血液。病程稍長者也只持續(xù)數(shù)小時后死亡。豬：多為局限性變化，呈慢性通過，臨床癥狀不明顯，常在宰后見病變。犬和其它肉食動物臨床癥狀不明顯。2.3病理變化死亡患病動物可視黏膜發(fā)紺、出血。血液呈暗紫紅色，凝固不良，粘稠似煤焦油狀。皮下、肌間、咽喉等部位有漿液性滲出及出血。淋巴結(jié)腫大、充血，切面潮紅。脾臟高度腫脹，達(dá)正常數(shù)倍，脾髓呈黑紫色。嚴(yán)禁在非生物安全條件下進(jìn)行疑似患病動物、患病動物的尸體剖檢。2.4實(shí)驗(yàn)室診療實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診療必須在對應(yīng)級別的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2.4.1病原鑒定2.4.1.1樣品采集、包裝與運(yùn)輸按照NY／T5612.1.2、4.1、5.1執(zhí)行。2.4.1.2病原學(xué)診療炭疽的病原分離及鑒定（見NY/T561）。2.4.2血清學(xué)診療炭疽沉淀反映（見NY/T561）。2.4.3分子生物學(xué)診療聚合酶鏈?zhǔn)椒从常≒CR）（見附件1）。3疫情報告3.1任何單位和個人發(fā)現(xiàn)患有本病或者疑似本病的動物，都應(yīng)立刻向本地動物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報告。3.2本地動物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報告后，按國家動物疫情報告管理的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4疫情解決根據(jù)本病流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診療做出的綜合鑒定成果可做為疫情解決根據(jù)。4.1本地動物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疑似炭疽疫情報告后，應(yīng)及時派員到現(xiàn)場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢查，采集病料送符合規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室診療，并立刻隔離疑似患病動物及同群動物，限制移動。對病死動物尸體，嚴(yán)禁進(jìn)行開放式解剖檢查，采樣時必須按規(guī)定進(jìn)行，避免病原污染環(huán)境，形成永久性疫源地。4.2確診為炭疽后，必須按下列規(guī)定解決。4.2.1由所在地縣級以上獸醫(yī)主管部門劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)。疫點(diǎn)：指患病動物所在地點(diǎn)。普通是指患病動物及同群動物所在畜場（戶組）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位。疫區(qū)：指由疫點(diǎn)邊沿外延3公里范疇內(nèi)的區(qū)域。在實(shí)際劃分疫區(qū)時，應(yīng)考慮本地喂養(yǎng)環(huán)境和自然屏障（如河流、山脈等）以及氣象因素，科學(xué)擬定疫區(qū)范疇。受威脅區(qū)：指疫區(qū)外延5公里范疇內(nèi)的區(qū)域。4.2.2本病呈零星散發(fā)時，應(yīng)對患病動物作無血撲殺解決，對同群動物立刻進(jìn)行強(qiáng)制免疫接種，并隔離觀察20天。對病死動物及排泄物、可能被污染飼料、污水等按附件2的規(guī)定進(jìn)行無害化解決；對可能被污染的物品、交通工具、用品、動物舍進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒（見附件2）。疫區(qū)、受威脅區(qū)全部易感動物進(jìn)行緊急免疫接種。對病死動物尸體嚴(yán)禁進(jìn)行開放式解剖檢查，采樣必須按規(guī)定進(jìn)行，避免病原污染環(huán)境，形成永久性疫源地。4.2.3本病呈暴發(fā)流行時（1個縣10天內(nèi)發(fā)現(xiàn)5頭以上的患病動物），要報請同級人民政府對疫區(qū)實(shí)施封鎖；人民政府在接到封鎖報告后，應(yīng)立刻公布封鎖令，并對疫區(qū)實(shí)施封鎖。疫點(diǎn)、疫區(qū)和受威脅區(qū)采用的解決方法以下：4.2.3.1疫點(diǎn)出入口必須設(shè)立消毒設(shè)施。限制人、易感動物、車輛進(jìn)出和動物產(chǎn)品及可能受污染的物品運(yùn)出。對疫點(diǎn)內(nèi)動物舍、場地以及全部運(yùn)載工具、飲水用品等必須進(jìn)行嚴(yán)格徹底地消毒。患病動物和同群動物全部進(jìn)行無血撲殺解決。其它易感動物緊急免疫接種。對全部病死動物、被撲殺動物，以及排泄物和可能被污染的墊料、飼料等物品產(chǎn)品按附件2規(guī)定進(jìn)行無害化解決。動物尸體需要運(yùn)輸時，應(yīng)使用防漏容器，須有明顯標(biāo)志，并在動物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督下實(shí)施。4.2.3.2疫區(qū)：交通要道建立動物防疫監(jiān)督檢查站，派專人監(jiān)管動物及其產(chǎn)品的流動，對進(jìn)出人員、車輛須進(jìn)行消毒。停止疫區(qū)內(nèi)動物及其產(chǎn)品的交易、移動。全部易感動物必須圈養(yǎng)，或在指定地點(diǎn)放養(yǎng)；對動物舍、道路等可能污染的場合進(jìn)行消毒。對疫區(qū)內(nèi)的全部易感動物進(jìn)行緊急免疫接種。4.2.3.3受威脅區(qū)：對受威脅區(qū)內(nèi)的全部易感動物進(jìn)行緊急免疫接種。4.2.3.4進(jìn)行疫源分析與流行病學(xué)調(diào)查4.2.3.5封鎖令的解除最后1頭患病動物死亡或患病動物和同群動物撲殺解決后20天內(nèi)不再出現(xiàn)新的病例，進(jìn)行終末消毒后，經(jīng)動物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)審驗(yàn)合格后，由本地獸醫(yī)主管部門向原公布封鎖令的機(jī)關(guān)申請公布解除封鎖令。4.2.4解決統(tǒng)計對解決疫情的全過程必須做好完整的具體統(tǒng)計，建立檔案。5防止與控制5.1環(huán)境控制喂養(yǎng)、生產(chǎn)、經(jīng)營場合和屠宰場必須符合《動物防疫條件審核管理方法》（農(nóng)業(yè)部[]15號令）規(guī)定的動物防疫條件，建立嚴(yán)格的衛(wèi)生（消毒）管理制度。5.2免疫接種5.2.1各省根據(jù)本地疫情流行狀況，按農(nóng)業(yè)部制訂的免疫方案，擬定免疫接種對象、范疇。5.2.2使用國家同意的炭疽疫苗，并按免疫程序進(jìn)行適時免疫接種，建立免疫檔案。5.3檢疫5.3.1產(chǎn)地檢疫按GB16549和《動物檢疫管理方法》實(shí)施檢疫。檢出炭疽陽性動物時，按本規(guī)范4.2.2規(guī)定解決。5.3.2屠宰檢疫按NY467和《動物檢疫管理方法》對屠宰的動物實(shí)施檢疫。5.4消毒對新老疫區(qū)進(jìn)行經(jīng)常性消毒，雨季要重點(diǎn)消毒。皮張、毛等按照附件2實(shí)施消毒。5.5人員防護(hù)動物防疫檢疫、實(shí)驗(yàn)室診療及喂養(yǎng)場、畜產(chǎn)品及皮張加工公司工作人員要注意個人防護(hù)，參加疫情解決的有關(guān)人員，應(yīng)穿防護(hù)服、戴口罩和手套，做好本身防護(hù)。

附件1聚合酶鏈?zhǔn)椒从常≒CR）技術(shù)1試劑1.1消化液1.1.11M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0)三羥甲基氨基甲烷12.11g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mL1.1.20.5M乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mL1.1.320%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液(pH7.2)十二烷基磺酸鈉20g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào)pH至7.2滅菌雙蒸水加至100mL1.1.4消化液配制1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0)2mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0)0.4mL20%十二烷基磺酸鈉溶液(pH7.2)5mL5M氯化鈉4mL滅菌雙蒸水加至200mL1.2蛋白酶K溶液蛋白酶K5g滅菌雙蒸水加至250mL1.3酚/氯仿/異戊醇混合液堿性酚25mL氯仿24mL異戊醇1mL1.42.5mmol/LdNTPdATP(100mmol/L)20μLdTTP(100mmol/L)20μLdGTP(100mmol/L)20μLdCTP(100mmol/L)20μL滅菌雙蒸水加至800μL1.58pmol/μLPCR引物上游引物ATXU（2OD）加入701μl滅菌雙蒸水溶解，下游引物ATXD（2OD）加入697μL滅菌雙蒸水溶解，分別取ATXU、ATXD溶液各300μL，混勻即為8pmol/μL擴(kuò)增引物。1.60.5單位TaqDNA聚合酶5單位TaqDNA聚合酶1μL滅菌雙蒸水加至10μL現(xiàn)用現(xiàn)配。1.710×PCR緩沖液1.7.11mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH9.0)三羥基甲基氨基甲烷15.8g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào)pH至9.0滅菌雙蒸水加至100mL1.7.210倍PCR緩沖液1mol/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH9.0)1mL氯化鉀0.373g曲拉通X-1000.1mL滅菌雙蒸水加至100mL1.8溴化乙錠(EB)溶液溴化乙錠0.2g滅菌雙蒸水加至20mL1.9電泳緩沖液(50倍)1.9.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mL1.9.2TAE電泳緩沖液(50倍)三羥基甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57.1mlL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0)100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時用滅菌雙蒸水稀釋使用1.101.5％瓊脂糖凝膠瓊脂糖3gTAE電泳緩沖液(50倍)4mL滅菌雙蒸水196mL微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20μL。1.11上樣緩沖液溴酚藍(lán)0.2g，加雙蒸水10mL過夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至100mL。1.12其它試劑異丙醇(分析純)70%乙醇15mmoL/L氯化鎂滅菌雙蒸水2器材2.1儀器分析天平、高速離心機(jī)、真空干燥器、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、液氮或-70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。2.2耗材眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20mL一次性注射器、1.5mL滅菌離心管、0.2mL薄壁PCR管、瓊脂糖、500mL量筒、500mL錐形瓶、吸頭(10μL、200μL、1000μL)、滅菌雙蒸水。2.3引物設(shè)計根據(jù)GenBank上已發(fā)表的炭疽桿菌POX1質(zhì)粒序列，設(shè)計并合成了下列兩條引物：ATXU：5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ATXD：5’-GTTGTAGATTGGAGCCGTC-3’，此對引物擴(kuò)增片段為394bp。2.4樣品的采集與解決2.4.1樣品的采集病死或撲殺的動物取肝臟或脾；待檢的活動物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測。2.4.2樣品的解決每份樣品分別解決。2.4.2.1組織樣品解決稱取待檢病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清100μL加入1.5mL滅菌離心管中，再加入500μL消化液和10μL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中4～16h。2.4.2.2待檢菌的解決取培養(yǎng)獲得的菌落，重懸于生理鹽水中。取其懸液100μL加入1.5mL滅菌離心管中，再加入500μL消化液和10μL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。2.4.2.3全血樣品解決待血凝后取上清放于離心管中，4℃8000g離心5分鐘，取上清100μL，加入500μL消化液和10μL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。2.4.2.4陽性對照解決取培養(yǎng)的炭疽桿菌，重懸于生理鹽水中。取其懸液100μL，置1.5mL滅菌離心管中，加入500μL消化液和10μL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。2.4.2.5陰性對照解決取滅菌雙蒸水100μL，置1.5mL滅菌離心管中，加入500μL消化液10μl蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。2.5DNA模板的提取2.5.1取出已解決的樣品及陰、陽對照，加入600μL酚/氯仿/異戊醇混合液，用力顛倒10次混勻，1g離心10分鐘。2.5.2取上清置1.5mL滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置液氮中3分鐘。取出樣品管，室溫融化，15000rpm離心15分鐘。2.5.3棄上清，沿管壁緩緩滴入1ml70%乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1分鐘，真空抽干15分鐘(以無乙醇味為準(zhǔn))。2.5.4取出樣品管，用50μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，作為模板備用。2.6PCR擴(kuò)增總體積20μl，取滅菌雙蒸水8μl,2.5mmol/LdNTP、8pmol/μL擴(kuò)增引物、15mmol/L氯化鎂、10×PCR緩沖液、0.5單位TaqDNA聚合酶各2μL，2μL模板DNA?；靹?，作好標(biāo)記，加入礦物油20μL覆蓋(有熱蓋的自動DNA熱循環(huán)儀不用加礦物油)。擴(kuò)增條件為94℃3分鐘后，94℃30s，58℃30s，72℃30s循環(huán)35次，72℃延伸5分鐘。2.7電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15μL混合3μL上樣緩沖液，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于1×TAE緩沖液中電泳，紫外凝膠成像儀下觀察成果。2.8成果鑒定在陽性對照出現(xiàn)394bp擴(kuò)增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時，實(shí)驗(yàn)成果成立。被檢樣品出現(xiàn)394bp擴(kuò)增帶為炭疽桿菌陽性，否則為陰性。

附件2無害化解決1炭疽動物尸體解決應(yīng)結(jié)合遠(yuǎn)離人們生活、水源等因素考慮，因地制宜，就地焚燒。如需移動尸體，先用5％福爾馬林消毒尸體表面，然后搬運(yùn)，并將原放置尸地及尸體天然孔出血及滲出物用5%福爾馬林浸漬消毒多次，在搬運(yùn)過程中避免污染沿途路段。焚燒時將尸體墊起，用油或木柴焚燒，規(guī)定燃燒徹底。無條件進(jìn)行焚燒解決時，也可按規(guī)定進(jìn)行深埋解決。2糞肥、墊料、飼料的解決被污染的糞肥、墊料、飼料等，應(yīng)混以適量干碎草，在遠(yuǎn)離建筑物和易燃品處堆積徹底焚燒，然后取樣檢查，確認(rèn)無害后，方可用作肥料。3房屋、廄舍解決開放式房屋、廄舍可用5%福爾馬林噴灑消毒三遍，每次浸漬2小時。也可用20％漂白粉液噴霧，200mL/m2作用2小時。對磚墻、土墻、地面污染嚴(yán)重處，在離開易燃品條件下，亦可先用酒精或汽油噴燈地毯式噴燒一遍，然后再用5％福爾馬林噴灑消毒三遍。對可密閉房屋及室內(nèi)櫥柜、用品消毒，可用福爾馬林熏蒸。在室溫18℃條件下，對每25～30m3空間，用10％濃甲醛液（內(nèi)含37％甲醛氣體）約4000mL，用電煮鍋蒸4小時。蒸前先將門窗關(guān)閉，通風(fēng)孔隙用高粘膠紙封嚴(yán)，工作人員戴專用防毒面具操作。密封8～12小時后，打開門窗換