寄生蟲實(shí)驗(yàn)技術(shù)-課件

病原學(xué)檢查糞便檢查血液檢查法排泄物與分泌物等的檢查其它組織器官檢查第一頁第二頁，共36頁。糞便檢查直接涂片法厚涂片透明法濃聚法沉淀法毛蚴孵化法浮聚法肛門拭子檢查法試管濾紙檢查法蟲卵計(jì)數(shù)法定量透明法淘蟲檢查法帶絳蟲孕節(jié)檢查法第二頁第三頁，共36頁。直接涂片法檢查蠕蟲卵、原蟲包囊和滋養(yǎng)體。簡(jiǎn)便，連作3次以提高檢出率。滴一滴生理鹽水于載玻片，用牙簽挑取綠豆大小的糞塊，在生理鹽水中涂抹均勻；厚度以可辨認(rèn)下面的字跡為宜。也可固定后染色。一般在低倍鏡下檢查，用高倍鏡觀察時(shí)加蓋片。檢查包囊時(shí)用碘液。檢查隱孢子蟲卵囊時(shí)用金胺酚改良抗酸染色法。第三頁第四頁，共36頁。厚涂片透明法取約5mg糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油－孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開。置于30～36℃溫箱中約半小時(shí)或25℃約1小時(shí)。待糞膜稍干，即可鏡檢。第四頁第五頁，共36頁。沉淀法原蟲包囊和蠕蟲卵等比重大時(shí)效果較好。重力（離心）沉淀法：取糞便20～30g，加水混懸后用2～3層濕紗布過濾；濾液靜置25分鐘或離心（1500～2000rpm）1～2分鐘，重復(fù)洗滌直至上清液清澈為止。最后取沉渣涂片鏡檢。檢查包囊時(shí)，換水間隔時(shí)間宜延長至約6h。第五頁第六頁，共36頁。浮聚法利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。檢查鉤蟲卵效果最好。飽和鹽水浮聚法：取黃豆粒大的糞便置于浮聚瓶中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口但不溢出為止。在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片迅速提起翻轉(zhuǎn)，鏡檢?？捎昧蛩徜\或蔗糖代替飽和鹽水。第六頁第七頁，共36頁。毛蚴孵化法在適宜溫度的清水中，血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴短時(shí)間內(nèi)可孵出。取糞便約30g，先經(jīng)沉淀法濃集，將糞便沉渣倒入三角燒瓶內(nèi)，加清水至瓶口，在20～30℃的條件下經(jīng)4～6小時(shí)后肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。如水面下有白色點(diǎn)狀物作直線來往游動(dòng)，即是毛蚴。必要時(shí)也可用吸管將毛蚴吸出鏡檢。第七頁第八頁，共36頁。毛蚴促孵法將沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶內(nèi)，不加水，或?qū)⒓S渣置于吸水紙上，再放在20～30℃溫箱中過液。檢查時(shí)，加清水，2小時(shí)后就可見到孵出的毛蚴。第八頁第九頁，共36頁。肛門拭子檢查法適于肛周產(chǎn)卵（蟯蟲），或肛門附近可發(fā)現(xiàn)蟲卵（帶絳蟲）的寄生蟲蟲卵檢查法。棉簽拭子法：將濕棉簽或角匙在肛門周圍擦拭，隨后將其放入盛有飽和鹽水的試管中充分溶解，然后取液面液體進(jìn)行鏡檢，也可離心后取沉渣鏡檢。透明膠帶法：用長約6cm，寬約2cm的透明膠帶粘擦肛門周圍皮膚，取下膠帶，平貼在玻片上鏡檢。第九頁第十頁，共36頁。試管濾紙培養(yǎng)法也稱鉤蚴培養(yǎng)法。根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)孵出幼蟲的原理設(shè)計(jì)的方法。加水約1ml于潔凈試管內(nèi)，將濾紙剪成與試管等寬但管稍長的T字型紙條。取糞便約0.2～0.4g，均勻地涂抹在紙條豎條的上部2／3處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，糞便不接觸水面。在20～30℃條件下培養(yǎng)3天后肉眼或放大鏡檢查試管底部。鉤蚴在水中作蛇形游動(dòng)，蟲體透明。第十頁第十一頁，共36頁。蟲卵計(jì)數(shù)法斯陶爾（Stoll）氏法。在三角燒瓶的頸部畫56和60ml兩個(gè)刻度。先加0.1mol/LNaOH溶液至56ml處，再加糞便到60ml處，然后放進(jìn)玻璃珠充分搖動(dòng)混懸。取0.075或0.15ml糞液置于載玻片，鏡下計(jì)算蟲卵數(shù)。乘以200或100得每克糞便蟲卵數(shù)。

雌蟲數(shù)＝每克糞便蟲卵數(shù)×24小時(shí)糞便克數(shù)/

已知雌蟲每天排卵總數(shù)成蟲總數(shù)＝雌蟲總數(shù)×2第十一頁第十二頁，共36頁。定量透明法蠕蟲卵的檢查及計(jì)數(shù)。將約4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋糞便，自篩網(wǎng)上刮取糞便，填滿置于載玻片上的定量板的?？?。掀起定量板，將留下的糞樣覆蓋一含甘油－孔雀綠溶液的約為5.0～2.6cm的玻璃紙條，展平加壓后糞便鋪成長橢圓形。經(jīng)1～2h糞便透明后鏡下計(jì)數(shù)。將所得蟲卵數(shù)×24，再乘糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)。第十二頁第十三頁，共36頁。淘蟲檢查法考核驅(qū)蟲療效，糞便中淘取蠕蟲鑒定計(jì)數(shù)。取服藥后24～72小時(shí)的全部糞便，加水?dāng)嚢?，用篩（40目）或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復(fù)沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲體時(shí)，應(yīng)在玻皿下襯以黑紙。第十三頁第十四頁，共36頁。帶絳蟲孕節(jié)檢查法絳蟲節(jié)片用清水洗凈，置于兩載玻片之間，輕輕壓平，對(duì)光觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲種。也可用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭素墨汁或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計(jì)數(shù)。第十四頁第十五頁，共36頁。血液檢查診斷瘧疾、絲蟲病。皮膚消毒后用取血針刺破皮膚，擠出血滴，用載玻片蘸取。然后用一邊緣光滑的載片為推片，將血滴推成血膜。充分晾干后，用甲醇或無水酒精對(duì)血膜進(jìn)行固定。然后進(jìn)行染色，晾干后鏡檢。第十五頁第十六頁，共36頁。排泄物與分泌物的檢查1．痰液可查肺吸蟲卵、棘球蚴的原頭蚴、糞類圓線蟲幼蟲、蛔蚴、鉤蚴等。先用直接涂片法檢查，陰性時(shí)改用濃集法。濃集法：收集多量痰液置玻璃杯中，加入等量10％NaOH溶液，攪勻后置37℃溫箱內(nèi)消化，待痰液變?yōu)橄∫簳r(shí)分裝離心管內(nèi)，以1500rpm離心5～10分鐘，取沉渣涂片檢查。第十六頁第十七頁，共36頁。排泄物與分泌物等的檢查2．十二指腸液和膽汁：檢查賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲卵、肝片形吸血卵和布氏姜片蟲卵等；可滴于載玻片上加蓋片后直接鏡檢。為提高寄生蟲檢出率，可加生理鹽水稀釋攪拌后，分裝離心管，以2000rpm離心5～10分鐘，取沉渣涂片鏡檢。如過于粘稠，先加10％NaOH消化后再離心。第十七頁第十八頁，共36頁。排泄物與分泌物等的檢查3．尿腎蟲病等。一般離心后取沉渣鏡檢。乳糜尿時(shí)需加等量乙醚，用力振蕩使脂肪溶于乙醚。然后除去脂肪層后離心，取沉渣鏡檢。4．陰道分泌物：伊氏錐蟲、陰道毛滴蟲等。直接涂片法。第十八頁第十九頁，共36頁。其它器官組織檢查1．骨髓：利什曼原蟲無鞭毛體等。直接涂片；甲醇固定，染色，油鏡檢查。2．淋巴結(jié)：利什曼原蟲、絲蟲成蟲：切面涂片，染色后鏡檢。3．直腸粘膜：日本血吸蟲卵及阿米巴滋養(yǎng)體等。從直腸粘膜病變組織取樣，壓片鏡檢或染色鏡檢。第十九頁第二十頁，共36頁。其它器官組織檢查4．肌肉壓片檢查：旋毛蟲幼蟲、豬囊尾蚴等。從腓腸肌或肱或股二頭肌取米粒大小的肌肉或肌肉結(jié)節(jié)，置于載玻片上，加50％甘油一滴，蓋上另一載玻片均勻用力壓緊，低倍鏡下觀察。須立即檢查，否則幼蟲變得模糊，不易檢出。也可經(jīng)組織固定后作切片染色檢查。第二十頁第二十一頁，共36頁。其它器官組織檢查5.皮屑檢查：疥螨。用刀片刮取健康部和病患交界處的痂皮進(jìn)行鏡檢（需出血）。直接檢查法：置平皿或黑紙上，曝曬或加熱（40-50℃），30-40分鐘后，移去皮屑檢查白色蟲體。顯微鏡鏡檢：置載玻片，滴加煤油、10％NaOH、液體石蠟，50％甘油后，上加另一載玻片按壓后檢查。蟲體濃集法：置試管中，加入10％NaOH后過夜或加熱使皮屑溶解，而后靜置或離心（2000rpm，5min）使蟲體沉淀后鏡檢。第二十一頁第二十二頁，共36頁。免疫學(xué)方法皮內(nèi)試驗(yàn)染色試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)免疫熒光酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)ELISA免疫酶染色試驗(yàn)單克隆抗體第二十二頁第二十三頁，共36頁。皮內(nèi)試驗(yàn)利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測(cè)皮膚丘疹及紅暈反應(yīng)以判斷有無特異抗體（IgE）的存在稱皮內(nèi)試驗(yàn)。操作簡(jiǎn)單，并且可即時(shí)觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。皮內(nèi)試驗(yàn)用于多種寄生蟲病的檢測(cè)，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于血吸蟲病的調(diào)查。第二十三頁第二十四頁，共36頁。染色試驗(yàn)染色試驗(yàn)（dye

test，DT）：獨(dú)特的免疫反應(yīng)，是目前診斷弓形蟲病較好的方法，廣泛用于該病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清混合，在37℃1小時(shí)或室溫?cái)?shù)小時(shí)后，大部分弓形蟲變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿性美藍(lán)染色時(shí)著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時(shí)，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍(lán)染色時(shí)，著色很淺或不著色。第二十四頁第二十五頁，共36頁。環(huán)卵沉淀試驗(yàn)以血吸蟲整卵為抗原的特異血清學(xué)試驗(yàn)。卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測(cè)血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強(qiáng)度并計(jì)數(shù)反應(yīng)卵的百分率（環(huán)沉率）。第二十五頁第二十六頁，共36頁。間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)是以紅細(xì)胞作免疫配體的載體，并以紅細(xì)胞凝集進(jìn)行讀數(shù)的血清學(xué)方法。最常用的紅細(xì)胞為綿羊或人（O型）紅細(xì)胞，IHA操作簡(jiǎn)便，敏感性高，適于現(xiàn)場(chǎng)使用，可作為輔助論斷，流行病學(xué)調(diào)查及綜合診斷方法。在多種寄生蟲感染中應(yīng)用，如血吸蟲，瘧疾、豬囊蟲，旋毛蟲，肺吸蟲，阿米巴，弓形蟲，肝吸蟲等。第二十六頁第二十七頁，共36頁。免疫熒光法免疫熒光法是對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異熒光染色的診斷技術(shù)。診斷瘧疾、絲蟲病及血吸蟲病、肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病及弓形蟲病等。1．直接法：每查一種抗原必須制備與其相應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體。目前很少應(yīng)用。2．間接法：也稱間接熒光抗體法。將抗原與未標(biāo)記的特異性抗體（如患者血清）結(jié)合，然后使之與熒光標(biāo)記的二抗（抗抗體）結(jié)合，三者的復(fù)合物可發(fā)出熒光。第二十七頁第二十八頁，共36頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液（血清，腦脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測(cè)。酶聯(lián)試驗(yàn)的基本操作過程可分為：①固相包被；②溫育洗滌；③加樣；④酶結(jié)合物反應(yīng)；⑤底物顯色；⑥終止反應(yīng)讀取結(jié)果等若干步驟。第二十八頁第二十九頁，共36頁。斑點(diǎn)ELISA斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA）是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，在固相載體上吸附抗原和抗體，然后和被測(cè)物反應(yīng)，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，目測(cè)或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測(cè)抗體，也可用來檢測(cè)抗原，由于該法檢測(cè)抗原時(shí)操作較簡(jiǎn)便，故目前多用于抗原檢測(cè)。第二十九頁第三十頁，共36頁。免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn)是以組織切片，印片或培養(yǎng)物涂片用作待檢材料進(jìn)行過氧化物酶特異免疫染色，在光鏡下檢示樣本的特異性抗原。在蠕蟲和原蟲感染中均有應(yīng)用。血吸蟲病、絲蟲病、囊蟲病、華支囊吸蟲病、肺吸蟲病、包蟲病和弓形蟲病等。第三十頁第三十一頁，共36頁。單克隆抗體單克隆抗體（McAb）廣泛用于寄生蟲病臨床與實(shí)驗(yàn)研究。分型和鑒定；免疫診斷方法以及寄生蟲感染免疫，保護(hù)性免疫和蟲苗制備等方面。用于瘧疾、弓形蟲病、血吸蟲病、肺吸蟲病、棘球蚴病、絲蟲病等方面。第三十一頁第三十二頁，共36頁。檢測(cè)新技術(shù)－分子生物學(xué)方法免疫印漬試驗(yàn)DNA探針技術(shù)PCR技術(shù)第三十二頁第三十三頁，共36頁。免疫印漬試驗(yàn)免疫印漬試驗(yàn)是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），電泳轉(zhuǎn)印及標(biāo)記免疫試驗(yàn)三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成的一種新型的免疫探針技術(shù)