Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)課件

Marfey法與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用

版權(quán)歸屬：百度文庫賬戶拜水8Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)目錄前言LC/MS決定氨基酸絕對構(gòu)型的原理

1.Marfey法分離機制的探討

2.Marfey法與質(zhì)譜的聯(lián)用

3.衍生化過程小結(jié)應(yīng)用舉例Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)前言常見的確定化合物立體結(jié)構(gòu)的方法有如下幾種：（1）化學(xué)轉(zhuǎn)變法；（2）旋光比較法；（3）旋光譜（ORD）和圓二色光譜（CD）；（4）單晶X－射線衍射法；（5）核磁共振法；（6）Marfey法與質(zhì)譜聯(lián)用。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

目前酶法和CD法已用于決定氨基酸的絕對構(gòu)型，但這些都是直接的方法，確定一種對映異構(gòu)體時需要相對大量的樣品及較長的分析時間，因為在分析之前必須將每種氨基酸分離出來。另一方面，色譜方法例如GC和HPLC已經(jīng)代替這些直接方法廣泛使用，氨基酸的絕對構(gòu)型是通過衍生化后，在非對映環(huán)境下比較對照品氨基酸的保留時間來決定的，這些色譜學(xué)方法的優(yōu)點在于分析所用的樣品用量少、節(jié)省時間，并且可以同時分析十種以上氨基酸。色譜學(xué)方法的缺點在于需要對照品氨基酸，對于含有非常見氨基酸的肽類是不適用的。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)1984年，Marfey發(fā)明了一種用HPLC來決定氨基酸絕對構(gòu)型的方法，該方法基于這樣一個原理：通過手性試劑進行衍生化，將D-和L-氨基酸用HPLC分離成對映異構(gòu)體。于是引入手性試劑FDAA（（1-氟-2，4-二硝基苯基-5）-L-丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide），被命名為Marfey試劑。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)氨基酸與Marfey試劑反應(yīng)所得衍生物用常用的HPLC進行分離，并在UV340nm處進行檢測。L-氨基酸衍生物常常先于對應(yīng)的D-氨基酸衍生物從柱上洗脫下來，在梯度洗脫的條件下，該方法能正確地確定氨基酸的絕對構(gòu)型，并且具有很高的靈敏度。因此，Marfey法廣泛用于肽類化合物的結(jié)構(gòu)確證，證實肽類合成中的外消旋作用。但是，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，將該方法用來分析含非常見氨基酸的肽類還是很困難的。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)常見的Marfey試劑如下所示：

L-FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺

L-FDVA:……………..……………..-L-纈氨酰胺

L-FDPA:……………..……………..-L-苯丙氨酰胺

L-FDIA:……………..……………..-L-異亮氨酰胺

L-FDLA:……………..……………..-L-亮氨酰胺

D-FDAA:……………..……………..-D-丙氨酰胺Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)其結(jié)構(gòu)如下：Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

為了將Marfey法與質(zhì)譜聯(lián)用的方法建立起來，必須解決如下三個問題：（1）解釋Marfey法用作色譜技術(shù)的分離機制，及其局限。（2）如何在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下有效地將Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)系起來，來檢測和確定目標(biāo)氨基酸。（3）如何從一個肽類樣品的L-或D- 氨基酸中獲得相應(yīng)的對映異構(gòu)體Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)LC/MS決定氨基酸

絕對構(gòu)型的原理Marfey法分離機制的探討Marfey法與質(zhì)譜的聯(lián)用衍生化過程Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)Marfey法分離機制的探討下圖是用LC/MS來決定肽中氨基酸絕對構(gòu)型的全過程，命名作“高級Marfey法”Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如圖所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成兩部分（sample1和sample2)。Sample1與FDAA衍生化后，直接用LC/MS分析，通過衍生物的保留時間和質(zhì)譜得以確定為何種氨基酸，如果檢測到有非常見氨基酸，其平面結(jié)構(gòu)可以通過其衍生物的質(zhì)譜得以闡明。Sample2主要用來決定非常見氨基酸的絕對構(gòu)型。由于天然存在的肽類往往由D-型或L-型氨基酸組成，在色譜圖上，每個氨基酸給出一個峰，其絕對構(gòu)型無法在這一步?jīng)Q定。因此，為了得到其對映體，Sample2中的氨基酸必須在適當(dāng)?shù)臈l件下進行外消旋化。但是，與FDAA衍生化及外消旋化后所得的色譜圖變得復(fù)雜了，很難發(fā)現(xiàn)一對差向異構(gòu)體。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在該法中使用了質(zhì)量色譜。每對差向異構(gòu)體有兩個峰，在以目標(biāo)氨基酸衍生物分子離子碎片的m/z值為檢測指標(biāo)的質(zhì)量色譜圖上可以選擇到這兩個峰。然后，通過比較Sample1中原峰的保留時間和Sample2中新產(chǎn)生峰的保留時間，就可以根據(jù)Marfey法中的洗脫規(guī)律來判定絕對構(gòu)型了。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)本法將可購得的氨基酸分為四類：中性氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、堿性和N-甲基氨基酸，在同樣的條件下研究其分離行為。

FDAA主要與氨基酸上未取代的氨基、酚羥基、巰基包括N-甲基反應(yīng)。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)每種氨基酸的非對映異構(gòu)體對都是通過其D-異構(gòu)體的保留時間(tRD)和L-異構(gòu)體的保留時間(tRL)的差值(△t)來判定的。當(dāng)△t值大于±1.0時，每組非對映異構(gòu)體對完全被分離為兩個非對映異構(gòu)體。左邊的表格顯示了四種氨基酸的兩種異構(gòu)體保留時間及其差異。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對中性氨基酸已經(jīng)獲得很好的判定，所有L-型非對映異構(gòu)體都先于D-型被洗脫下來。隨著烴基側(cè)鏈增長，判定效率提高，保留時間也會更長（亞氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到兩衍生物，因為FDAA會引入到－NH2上，也會引入到酚－OH上。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)酸性或含－OH氨基酸的判定相對于中性氨基酸要難一些。因為其保留時間變短。側(cè)鏈含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更難判定。在含－OH的氨基酸中，絲氨酸顯示出最差的判定能力，但是高絲氨酸的判定稍好些，氧甲基絲氨酸顯示了與丙氨酸相似的判定能力。另外，β-OH天冬氨酸的兩個非對映異構(gòu)體顯示相反的洗脫規(guī)律，而且它們的保留時間極短Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對于堿性氨基酸，賴氨酸和鳥氨酸有三種衍生物：單α-取代、單ω-取代和二取代衍生物；組氨酸有兩種衍生物，單α-取代和雙取代衍生物。它們的單α-取代和雙取代可被判定，而單ω-取代衍生物無法判定，表明α-氨基的衍生化對于判定是必要的。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)但是堿性氨基酸的洗脫規(guī)律取決于所選流動相的PH大小，可能為LD的常規(guī)順序，也可能相反。賴氨酸和組氨酸的雙衍生物顯示了正常的洗脫規(guī)律，而鳥氨酸卻顯示相反的順序，盡管它們有較長的保留時間。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)購得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物，盡管其保留時間長于各母氨基酸，但其判定能力要低于母氨基酸。尤其是N-甲基丙氨酸無法判定，N-甲基天冬氨酸以相反順序被洗脫出。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)綜上，F(xiàn)DAA的L-氨基酸衍生物并不總是先于對應(yīng)的D-氨基酸衍生物被洗脫下來。因此，闡明不了分離機制，Marfey法就不能用于非常見氨基酸的判定。此外，實驗結(jié)果表明以下兩點對于洗脫順序至關(guān)重要：①氨基酸的疏水性；②在分離過程中FDAA衍生物的構(gòu)象。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)使用UV（二極管陣列檢測器）和NMR方法來解決該問題（因為，它們易受構(gòu)象的影響）。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如上圖所示，在340和414nm處有特征性最大吸收，是由二硝基苯上的硝基與氨基酸及L-丙氨酰胺的－NH2之間的氫鍵所形成的發(fā)色團產(chǎn)生的；而且，D-纈氨酸衍生物的UV譜與其L-型衍生物的相符。所有被測氨基酸的衍生物顯示非常相似的UV譜，脯氨酸和N-甲基氨基酸除外。尤其是給出相反洗脫順序的雙取代衍生物及D-和L-鳥氨酸顯示了特征的UV譜，其吸收波長從340nm藍移到320nm。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)這些結(jié)果表明，穩(wěn)定的構(gòu)象，包括分子內(nèi)氫鍵，形成了一個像蒽一樣的三環(huán)系統(tǒng)的平面分子（如下圖所示）。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)綜上，對于L-和D-氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差異，源于氨基酸和L-丙氨酰胺α－碳上兩個疏水性取代基的順／反位置。于是，順式排列的FDAA衍生物與ODS作用更強烈，比反式排列的衍生物有更長的保留時間。對于大多數(shù)氨基酸來說，由于氨基酸側(cè)鏈取代基的疏水性往往小于－COOH，D-氨基酸衍生物具有順式結(jié)構(gòu)，因此在Marfey法中L-氨基酸衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。另有文獻證明，氫鍵的形成對結(jié)構(gòu)的判定也是很有用的。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)L-纈氨酸的FDAA衍生物的NOE實驗顯示，纈氨酸的α-質(zhì)子及L-丙氨酰胺的α-質(zhì)子與苯環(huán)的H－6之間存在著強烈的NOE，如上圖所示；而H－6與纈氨酸的異丙基和L-丙氨酰胺的甲基之間沒有NOE。另外，D-纈氨酸的FDAA衍生物與L-衍生物幾乎顯示相同的NMR行為。這些結(jié)果表明，兩α-質(zhì)子都在空間上位于苯環(huán)H－6的附近，在L-和D-纈氨酸衍生物中均如此。由此，纈氨酸和丙氨酰胺的除－NH2以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，在溶液中是穩(wěn)定的，也是占優(yōu)勢的。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如圖所示：D-纈氨酸的FDAA衍生物為順（Z）－式排列，兩個疏水性取代基在同側(cè)；L-纈氨酸的FDAA衍生物為反（E）－式排列，兩個疏水性基團在異側(cè)。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為了確定α－COOH是否對結(jié)構(gòu)的判定必不可少，文章對氨基酸甲酯和脫－COOH的氨基化合物的FDAA衍生物進行了研究。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所測氨基酸甲酯及氨基化合物的判定結(jié)果如上表所示，它們的UV譜與母氨基酸的完全相同，保留時間比母氨基酸長，氨基酸甲酯的判定能力下降。另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定，絲氨酸甲酯衍生物顯示相反的洗脫順序。氨基化合物的保留時間和判定能力幾乎與其母氨基酸相同。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)果表明，α－COOH對于氨基酸的判定并不總是必須的。前已述，與中性氨基酸相比，酸性和含－OH氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力差，尤其是β-OH天冬氨酸、絲氨酸甲酯,給出了相反的洗脫順序（DL）。這些數(shù)據(jù)進一步證實一個氨基酸的FDAA衍生物在氨基酸和L-丙氨酰胺部分有兩個處于反式的疏水性取代基，要比其相應(yīng)的順式氨基酸衍生物先流出反相柱。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以上結(jié)果也可如下證實，考察用FDPA、FDVA、FDIA、FDLA和D-FDAA的氨基酸衍生物的分離行為，如下表所示：Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如所預(yù)期，隨著烴基側(cè)鏈增長，其保留時間也增長，判定能力也增強；而D-FDAA的氨基酸衍生物則顯示了相反的洗脫順序。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)本機理有一缺陷，即明確地評價兩個功能基團的疏水性是有困難的，可以考慮用氨基酸衍生物保留時間的順序來解釋洗脫順序。因為在氨基酸中α－COOH是一個常見的功能基團，而一個氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也決定于該氨基酸的側(cè)鏈，因此，DL-氨基酸的tR和洗脫順序間的關(guān)系已如Table1所示。如Figure4所示，具有常規(guī)洗脫順序（LD）的D-和L-氨基酸衍生物的tR要比側(cè)鏈?zhǔn)杷耘cα－COOH相當(dāng)?shù)陌被嵫苌锏拈L，例如絲氨酸和天冬氨酸。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)另一方面，具有相反洗脫順序的氨基酸衍生物具有相對較短的平均保留時間。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)于是，目標(biāo)氨基酸的洗脫順序可以用L-和D-氨基酸衍生物的平均保留時間進行解釋。DL-絲氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作臨界樣品，它們的平均保留時間位于洗脫順序的臨界點上。然而，鳥氨酸的二取代衍生物表現(xiàn)出非常有趣的分離行為，它們的洗脫順序是相反的，盡管它們有相對較長的保留時間（27.3min），如Figure4所示。對這種分離行為的研究正在進行之中。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)至此，第一個問題已基本得到解決。由于氨基酸與L-FDAA所得衍生物的熱不穩(wěn)定性和低疏水性，致使它們對LC/MS分析的敏感性很差。于是，選擇電噴霧離子化和frit-FAB作為接口，并發(fā)展用(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即L-FDLA取代FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作為衍生化試劑，以便將Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)系起來。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)Marfey法與質(zhì)譜的聯(lián)用在Marfey法中，氨基酸的L-FDAA衍生物由常規(guī)的反相HPLC分離并在UV340nm處檢測；在本法中，UV檢測器被換成質(zhì)譜儀，即氨基酸衍生物經(jīng)LC/MS分析。為了順利地將傳統(tǒng)的HPLC條件改為適合LC/MS分析的LC條件，必須解決如下兩個問題：Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（1）將從HPLC洗脫出來的液體注入質(zhì)譜儀時，其體積應(yīng)大大減小，因為ESI和frit-FAB是最終被作為一種接口來使用的。（2）HPLC流動相中的非揮發(fā)性緩沖液應(yīng)用揮發(fā)性緩沖液代替。解決方法：（1）應(yīng)用半微量柱（150×2.1mmI.d,），本法用該柱給予L-和D-氨基酸衍生物以足夠的分離度。若為frit-FABLC/MS溶液流速應(yīng)進一步減小至5μl/min。（2）使用TFA或醋酸銨緩沖液（PH＝3）作為流動相，與使用磷酸緩沖溶劑系統(tǒng)有幾乎相同的分離度。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)嘗試了4種用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的LC/MS接口，即ESI、大氣壓化學(xué)離子化（APCI）、TSP、和frit-FAB。極性氨基酸衍生物不能用TSP和APCI作為接口。盡管任何氨基酸都可以用ESI和frit-FAB接口，但它們的靈敏度特別低，這可能是由于氨基酸的L-FDAA衍生物的熱不穩(wěn)定性和低疏水性造成的，表明需要制備一種高疏水性的衍生化試劑。此外，ESI和frit-FAB被選作接口，還因為使用這種接口可以抑制溫度誘導(dǎo)效應(yīng)。在FAB-MS中，疏水性越強的化合物其分離效果越好。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)衍生化過程引入了一個外消旋化程序，使用DL-FDLA代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)外消旋化，以得到L-或D-氨基酸相應(yīng)的對映異構(gòu)體。為了獲得滿足以下條件的衍生化試劑：（1）可獲得更高疏水性的氨基酸衍生物；（2）不減少以前L-FDAA衍生物的特征UV吸收；（3）符合通常所言的分離機制。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)］嘗試了4種衍生化試劑L-FDVA、L-FDPA、L-FDIA和L-FDLA，具體數(shù)據(jù)如Table1所示：（1）被測衍生化試劑的保留時間要比L-FDAA長；（2）L-FDLA［M+H］+的離子豐度最高，約為L-FDAA的30倍。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由Table2可知，L-FDLA的分離效果要強于L-FDAA由Table1、Table2得，L-FDLA是用于LC/MS分析的最有效的衍生化試劑。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為了確證L-FDLA的實用性，L-FDLA的氨基酸衍生物使用以frit-FAB或ESI作為接口的LC/MS進行分析。為了比較氨基酸的L-FDAA衍生物和L-FDLA衍生物在相同條件下的電離情況，兩種衍生物的等量混合物進行LC/MS分析。如Ffigure1所示Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)DL-丙氨酸的L-FDAA和L-FDLA衍生物的［M+H］+陽離子質(zhì)量色譜，其整體質(zhì)譜使用frit-FAB作為接口。L-FDLA衍生物的靈敏度比L-FDAA衍生物的提高了三倍，這種趨勢適合于任何常見氨基酸。對于ESILC/MS，不管采用陽離子還是陰離子模式，靈敏度都提高2～4倍。由上可知，L-FDLA不僅適用于HPLC分析，也適用于LC/MS分析。使用frit-FAB和ESILC/MS的檢測限分別為10和5pmol。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)通常，天然存在的氨基酸都是由D-或L-構(gòu)型的氨基酸組成的，每種氨基酸只能在色譜圖上顯示一個峰,絕對構(gòu)型不能通過其他方法來解決。因此，為了從D/L氨基酸獲得一對對映體，進行外消旋化是很有必要的。最初使用的外消旋化方法為：水解產(chǎn)物+醋酐+三乙胺唑酮中間體外消旋化的N-乙?；被崴饽繕?biāo)產(chǎn)物Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)優(yōu)點：對于肽中少數(shù)氨基酸來說是簡單可行的。缺點：①耗時；②難于終止外消旋化作用；③當(dāng)氨基酸中含兩個不對稱碳原子（如蘇氨酸、亮氨酸）時，就不能給出對映異構(gòu)體的混合物，而是非對映體的混合物。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如上圖所示，D-氨基酸的L-FDLA衍生物（D－L型）和L-氨基酸的L-FDLA（L－L型）衍生物是非對映異構(gòu)體，在色譜圖上給出不同的保留時間；另一方面，L－D和D－L型、D－D和L－L型是對映異構(gòu)體，每一對都顯示相同的保留時間，即某氨基酸的D-FDLA衍生物與該氨基酸的對映異構(gòu)體的L-FDLA衍生物有相同的保留時間。據(jù)此，有望以D-和L-FDLA的等量混合物代替只以L-FDLA做衍生化試劑，來得到前述的外消旋化作用。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)上圖還表明，用D/L-FDLA進行衍生化是可行的，該方法用于含兩個不對稱碳原子的氨基酸時，所得兩個峰對應(yīng)于原氨基酸和其對映異構(gòu)體的L-FDLA衍生物。此外，化學(xué)外消旋化和D/L-FDLA衍生化相結(jié)合用于含兩個不對稱碳原子的氨基酸時，可能在HPLC譜中產(chǎn)生四個異構(gòu)體峰。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)小結(jié)

至此，LC/MS聯(lián)用的三個問題已得到解決：問題一：采用什么色譜技術(shù)來分離氨基酸。我們采用Marfey法作為色譜技術(shù)。問題二：怎樣有效地將Marfey法與質(zhì)譜聯(lián)系起來。我們采用ESI和Frit-FAB作為接口。問題三：怎樣能得到D-或L-氨基酸的對映體。使用了用來衍生化的L-FDLA和用來外消旋化的D/L-FDLA代替FDAA。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)這樣就建立了一個運用LC/MS，稱作“advancedMarfey’smethod”的非經(jīng)驗性方法，該法有三部分組成：⑴用于分離氨基酸的色譜技術(shù)：Marfey法；⑵通過質(zhì)譜方法檢驗氨基酸；⑶從L-或D-氨基酸得到相應(yīng)的對映異構(gòu)體的過程。本法的突出優(yōu)點是：①可以在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下確定絕對構(gòu)型；②可以同時分析肽鏈中的任何氨基酸。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用舉例該法已經(jīng)成功運用于肽鏈中氨基酸的結(jié)構(gòu)確定。還用于研究伯胺類化合物、仲醇類化合物和含噻唑環(huán)的氨基酸等的絕對構(gòu)型。下面簡要介紹一下運用該法對藻青菌（cyanobacteria）所產(chǎn)生的microcystinLR中的氨基酸的結(jié)構(gòu)研究。Marfey法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)MicrocystinLR是一種毒性環(huán)肽，由七個氨基酸片段組成，