不同類型煙草葉片中鉀代謝相關(guān)基因的表達(dá)及鉀利用率研究

不同類型煙草葉片中鉀代謝相關(guān)基因的表達(dá)及鉀利用率研究

鉀含量是優(yōu)質(zhì)葉片最重要的品質(zhì)指標(biāo)之一。葉片中的鉀離子不僅參與葉片的生理生化反應(yīng)，而且與煙草行為的抗逆性密切相關(guān)。同時(shí)，它決定了香煙的內(nèi)部質(zhì)量和工業(yè)可用性。對(duì)卷煙企業(yè)來(lái)說,煙葉含鉀量是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,同時(shí)也與煙葉的安全性有較強(qiáng)的相關(guān)性。在我國(guó),大部分煙區(qū)烤煙的含鉀量?jī)H為1.5%左右,含鉀量較高的也只有2%左右,與美國(guó)等先進(jìn)國(guó)家有較大的差距。鉀是植物生長(zhǎng)必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素,有重要的營(yíng)養(yǎng)和生理作用,同一植物不同品種或不同植物對(duì)鉀的吸收、分配、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用效率等方面存在著很大的差異。在低鉀條件下,高效基因型與低效基因型相比,具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。鉀效率的高低歸結(jié)于吸收效率和利用效率兩個(gè)方面,即根系對(duì)土壤鉀的活化和吸收能力;以及植物體內(nèi)鉀的運(yùn)輸、同化等利用能力。如何提高煙葉的含鉀量是當(dāng)前煙草工業(yè)研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。煙葉含鉀量取決于煙草品種基因型和在環(huán)境中的表達(dá)。因此,選擇一定施鉀量下吸收和積累能力強(qiáng)的品種類型無(wú)疑是最有效的措施,而當(dāng)前持續(xù)依靠增施鉀肥以提高煙葉含鉀量的方法無(wú)法治本。植物細(xì)胞通過其膜上的各種K+通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)K+進(jìn)出細(xì)胞,這些通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制迄今仍不十分清楚,但已有部分相關(guān)基因得到克隆和研究。植物中第一個(gè)鑒定的K+運(yùn)輸?shù)幕蚴荎AT1,互補(bǔ)試驗(yàn)證明KAT1基因可恢復(fù)酵母突變體在低鉀水平下的生長(zhǎng)。煙草的NtTPK1基因編碼一個(gè)疏水膜蛋白,包含典型的K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能保守域,并且與主要的高等植物K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因具有較高的同源性。NtTPK1具有TXXTXGYGD的特征序列,因此,可能具有KCO家族的K+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的生物學(xué)功能。另外煙草K+通道基因NKT1的主要功能是吸收K+;GORK在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá),控制K+流入和流出保衛(wèi)細(xì)胞。CIPK23通過磷酸化作用調(diào)控K+通道蛋白KAT1的活性,從而調(diào)節(jié)植物在低K+脅迫下的K+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),而CIPK23的活化又依賴于鈣信號(hào)感受器CBL1(或CBL9)在質(zhì)膜上的正向調(diào)控。研究KAT1、NtTPK1和NKT1等基因的表達(dá)調(diào)節(jié)與K+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系,了解調(diào)節(jié)K+吸收的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型,有助于理解K+通道、高親和力K+運(yùn)輸體和與K+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系在K+吸收和植物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)代謝中的作用。本文通過定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)技術(shù),檢測(cè)高鉀和低鉀不同煙草株系中與鉀吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的12個(gè)基因在葉片中的表達(dá)情況,尋找其中與鉀含量相關(guān)的關(guān)鍵基因,根據(jù)這些基因的表達(dá)情況來(lái)預(yù)測(cè)選育品種的品質(zhì),以期為種質(zhì)選育尋找快速有效的鑒定方法。1材料和方法1.1煙草鉀基因型篩選應(yīng)用花粉管通道法于1999年以空心蓮子草、商陸和馬齒莧為供體,烤煙品種K326為受體,配制導(dǎo)入組合3個(gè),獲導(dǎo)入當(dāng)代種子(D0)2595粒,從2000—2009年,以成熟期分別取中部烤后煙葉測(cè)定煙葉鉀含量,以煙葉鉀含量指標(biāo)高于2.5%為主要選擇壓力,同時(shí)考慮株型和抗病性進(jìn)行連續(xù)10年的定向選擇,篩選得到D10代5個(gè)株系,分別為煙草鉀高效基因型(以下簡(jiǎn)稱高鉀)K2、K3、K5、K7和K9,并以煙草鉀低效基因型(以下簡(jiǎn)稱低鉀)K326(CK)作為對(duì)照,2010年按湖南省優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草實(shí)驗(yàn)基地內(nèi),并對(duì)所有煙株進(jìn)行平頂處理。1.2不同供鉀量對(duì)煙毒及微量元素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響采用自然光照,將煙草種子播種于盛有基質(zhì)的漂浮盤中育苗,待煙苗長(zhǎng)至5片真葉時(shí),選取生長(zhǎng)均勻一致的煙苗,于2010年5月12日移至內(nèi)徑為15cm,高為20cm的塑料花盆中沙培(沙土比為3∶1),每盆1株。設(shè)6個(gè)處理,2個(gè)供鉀水平(高供鉀水平6mmolL–1和低供鉀水平0.6mmolL–1),3次重復(fù),烤煙所需的鉀來(lái)源于KNO3。于移栽當(dāng)天取各處理煙葉提取總RNA,采用qRT-PCR分析鉀離子代謝相關(guān)基因表達(dá)水平;分別于移栽25d和移栽45d后,每重復(fù)選取5株生長(zhǎng)整齊一致的煙株分析各處理鉀素利用效率。1.3rna的分離純化根據(jù)Verwoerd等方法取K2、K3、K7、K9與對(duì)照植株5片真葉,剪碎,用液氮磨成干粉狀,立即分裝至事先裝有1.0mLTrizol提取液(Invitrogen)的1.5mL離心管,每管約100mg,標(biāo)記、蓋緊、搖動(dòng),使樣品與Trizol提取液充分混合,加200μL氯仿,振蕩混勻,4℃,12000×g離心15min,小心吸出上層水相,轉(zhuǎn)入另一離心管,加500μL異丙醇,–20℃沉10min,12000×g離心10min分離出RNA,再經(jīng)75%酒精洗滌,室溫微干后,加適當(dāng)體積RNase-free水,充分溶解,測(cè)量RNA濃度。1.4cdna的合成使用PrimerExpression3.0軟件(AppliedBiosystems,美國(guó))設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)PCR引物,根據(jù)已知鉀離子代謝相關(guān)基因NtTPK1(EU161633)、NKT1(AB196790)、NtKC1(AB196791)、NKC1(DQ630714)、TORK1(AB196792)、CBL1(NM_202837)、CBL9(NM_124081)、CIPK23(NM_102766)、KAT1(NM_123993)、KAT2(NM_117939)、GORK(NM_123109)、SKOR(NM_111153)的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1),以煙草肌動(dòng)蛋白基因(Actingene,AccessionNo.U60495)為內(nèi)參基因,依據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物(表1)。用購(gòu)于Fermentas公司的DNase處理提取的總RNA以去除混入的基因組DNA(按廠家提供的處理步驟)。利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA。以cDNA為模板,按照SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(Toyobo,Japan)說明書操作,在ABI7900HT(AppliedBiosystems,美國(guó))上進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為12.5μLSYBRGreenRealtimePCRMasterMix,1μLcDNA,10μmolL–1PCR上有引物0.5μL,10μmolL–1PCR下游引物0.5μL,補(bǔ)蒸餾水至總體積25μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃60s;35循環(huán)(95℃60s,65℃35s)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。設(shè)樣本和內(nèi)參各3個(gè)重復(fù),采用相對(duì)定量分析法分析數(shù)據(jù),目的基因相對(duì)表達(dá)量Rel.Exp=2–ΔΔCt。其中,ΔΔCt=(CalibratorΔCt)–(未知樣品ΔCt),未知樣品ΔCt=(內(nèi)參基因Ct)–(目的基因Ct),CalibratorΔCt=(參比樣內(nèi)參基因Ct)–(參比樣目的基因Ct)。1.5耗竭液濃度的測(cè)定對(duì)移栽后沙培的煙株7d澆一次Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液,長(zhǎng)至7~8片真葉時(shí),選取生長(zhǎng)均勻一致的煙苗進(jìn)行耗竭試驗(yàn)。在耗竭試驗(yàn)開始前,將煙苗放在無(wú)鉀營(yíng)養(yǎng)液中處理48h,調(diào)節(jié)pH值為6.0,鉀饑餓處理期間每天更換饑餓液1次。耗竭試驗(yàn)開始時(shí),將煙苗放入含200mL耗竭液的黑色三角瓶中(耗竭液的組成為:0.4mmolL–1KNO3,0.2mmolL–1CaSO4,5mmolL–1Mes,用Tris堿調(diào)pH值至6.0),每隔1h取一次樣,直到耗竭液中鉀濃度接近零時(shí)結(jié)束取樣。每次取1mL耗竭液,同時(shí)補(bǔ)充1mL去離子水,使耗竭液的體積保持不變。最后在吸收液濃度保持相對(duì)穩(wěn)定時(shí)取樣即可獲得Cmin值(即吸收速率為零時(shí)環(huán)境離子的濃度),用火焰光度計(jì)法測(cè)定耗竭液的鉀濃度。取樣結(jié)束后取出植株,用吸水紙吸干根系表面的水分,稱根鮮重。按吸收動(dòng)力學(xué)方法,得出一元二次方程模型Y=a+bX+cX2(式中,X代表吸收時(shí)間,Y代表該時(shí)刻耗竭液中鉀濃度),獲得a、b、c值,不考慮a、b、c的正負(fù)號(hào)。養(yǎng)分流入速率α=Imax/Km1.6試驗(yàn)處理和煙樣對(duì)試驗(yàn)材料采用大區(qū)對(duì)比設(shè)計(jì),共設(shè)4個(gè)處理,3次重復(fù),以K326為對(duì)照,每處理666.7m2,分別于2010年在貴州貴陽(yáng)和湖南永州兩地種植,按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)管理。待各處理煙葉生長(zhǎng)至工藝成熟期,按三段式烘烤工藝標(biāo)準(zhǔn)烘烤,烤后從兩地每處理取B2F、C3F、X2F3個(gè)等級(jí)煙樣各2.5kg,送湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,分析品質(zhì)。參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T173-2003,采用火焰光度法測(cè)定煙葉鉀含量。1.7處理數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件中One-wayANOVA進(jìn)行方差分析和多重比較,用f檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),LSD法進(jìn)行多重比較。2結(jié)果與分析2.1不同品系中or118個(gè)基因的表達(dá)水平比較NtTPK1、NKT1、NtKC1、NKC1、TORK1、CBL1、CBL9、CIPK23、KAT1、KAT2、GORK和SKOR12個(gè)基因在不同品系中的表達(dá)水平(圖1)。由圖可知,5個(gè)高鉀品系的NKC1、NKT1、CBL1、CIPK23、KAT2、SKOR基因表達(dá)量均明顯高于對(duì)照K326,另外發(fā)現(xiàn)K2和K7這2個(gè)品系中,除K2的Ntkc1基因和K7的NKC1基因與其他品系差異不明顯外,所檢測(cè)的其余基因表達(dá)水平要明顯高于其他品系,因此認(rèn)為這2個(gè)品系可能是典型的高鉀材料,另外K9品系中各個(gè)基因的表達(dá)水平也相對(duì)較高。2.2鉀代謝基因檢測(cè)比較NtTPK1、NKT1、NtKC1、NKC1、TORK1、CBL1、CBL9、CIPK23、KAT1、KAT2、GORK和SKOR鉀代謝基因在5個(gè)典型高鉀品系中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)基因TORK1和NtTPK1要顯著高于其他基因(圖2),另外CIPK23基因的表達(dá)水平也相對(duì)較高。2.3uf06d-1h,k326根系對(duì)鉀的吸收速率由表2可知,6個(gè)烤煙根系吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)Imax、Km、Cmin、α值都存在差異。其中Imax和α值的差異相對(duì)明顯,表現(xiàn)為K3>K5>K9>K7>K2>K326,K3根系對(duì)鉀的最大吸收速率為318.8uf06dmolFWg–1h–1,而K326根系對(duì)鉀的最大吸收速率為52.2uf06dmolFWg–1h–1,前者為后者的6.11倍。6個(gè)基因型烤煙對(duì)鉀的親和力(Km)和Cmin的差異相對(duì)較小,表現(xiàn)為K2>K326>K7>K9>K3>K5。通常Imax大,Km小的作物吸鉀能力大、吸鉀潛力高,耐貧瘠能力強(qiáng),根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)印證了K3、K5、K9、K7、K2等高鉀材料的吸鉀能力強(qiáng)于對(duì)照K326,但根系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明K7、K2的吸鉀能力在低鉀水平下弱于K3、K5、K9,這與鉀代謝相關(guān)基因在K7、K2兩個(gè)株系中表達(dá)量高相悖,這可能是相同煙株在不同的生育時(shí)期鉀吸收能力存在一定差異所致。2.4高鉀基因型煙酒-23.由表3可知,在高供鉀水平下,移栽25d和移栽45d高鉀基因型烤煙的鉀生物利用率明顯高于對(duì)照K326。在移栽25d,高鉀基因型烤煙生物利用率的變化范圍在15.4~17.6gmg–1之間,比K326高出4.6%~19.2%;移栽45d,高鉀基因型烤煙生物利用率的變化范圍在43.2~38.1gmg–1,比K326高出2.4%~14.8%。而高鉀基因型烤煙的鉀經(jīng)濟(jì)利用率同對(duì)照K326間存在明顯差異,在移栽25d,表現(xiàn)為K2、K3>K326>K5、K7、K9,但在移栽45d,都低于對(duì)照K326。在移栽45d,5個(gè)高鉀基因型烤煙鉀的經(jīng)濟(jì)利用效率較低。表明高鉀基因型烤煙高鉀環(huán)境下鉀素吸收能力強(qiáng)但利用率較低。當(dāng)外界鉀濃度降為0.6mmolL–1時(shí),移栽25d的高鉀基因型烤煙的鉀生物利用率和經(jīng)濟(jì)利用率都高于K326,其鉀生物利用率變化范圍為68.0~98.8gmg–1,比K326高出18.2%~71.9%,鉀經(jīng)濟(jì)利用率的變化范圍為49.2~77.4gmg–1,比K326高出4.8%~65.0%;在移栽45d,各高鉀基因型烤煙(除K3外)的鉀生物利用率高于K326,其變化范圍為170.6~211.8gmg–1,比K326高出0.2%~24.4%,而K3比K326低0.037gmg–1。其經(jīng)濟(jì)利用率由于生長(zhǎng)后期煙葉重量增加不明顯,K3和K5分別比K326低1.28gmg–1和1.31gmg–1。表明高鉀基因型烤煙在低鉀環(huán)境下鉀素吸收能力強(qiáng)且利用率相對(duì)較高,尤其是K2、K7和K9鉀經(jīng)濟(jì)利用率相對(duì)較高。2.5不同部位葉中各部位各部位各部位的鉀含量以K326為對(duì)照,分別在貴州貴陽(yáng)和湖南永州兩地種植,分析烤后煙葉的B2F、C3F、X2F等級(jí)鉀含量(表4)。結(jié)果表明,K7、K2的上、中、下3個(gè)部位煙葉鉀含量均高于2.5%,與K326相比差異顯著,K9除上部葉與K326差異不明顯外,中部葉和下部葉與K326相比差異顯著。K326的中部葉鉀含量接近于選擇壓力2.5%,這可能與所選試驗(yàn)地土壤速效鉀含量有關(guān)。3植物養(yǎng)分利用效率本試驗(yàn)由鉀代謝基因表達(dá)水平的檢測(cè)和煙葉鉀含量分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),K2、K7和K9煙草品系的TORK1和NtTPK1基因的表達(dá)水平相對(duì)較高,在植物鉀含量的累積過程中起著很重要的作用,可能是調(diào)節(jié)K+通道的目的基因(K+in),導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上HATPase激活超極化促使內(nèi)向整流鉀離子通道打開,K+內(nèi)流,或者是植物缺鉀時(shí)引起高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體的誘導(dǎo)表達(dá)的目的基因,這是關(guān)鍵的鉀饑餓脅迫響應(yīng)機(jī)制。動(dòng)力學(xué)參數(shù)排序的多樣性能反映自然界作物品種鉀營(yíng)養(yǎng)效率的多樣性,故針對(duì)系鉀吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)高鉀株系的高效吸鉀能力進(jìn)行了驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果表明K3、K5、K9、K7和K2高鉀型的鉀吸收能力強(qiáng)于對(duì)照K326,證明了上述品系是高效吸鉀基因型,鉀營(yíng)養(yǎng)效率是受作物本身的基因型決定的而且是可以遺傳的。但K7、K2的吸鉀能力在低鉀水平下弱于K3、K5、K9,與前面這兩個(gè)品系的基因表達(dá)量較高看似相悖,這可能是相同品種在生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期吸鉀能力有差異所致。養(yǎng)分利用效率是表示植物生產(chǎn)力的重要指標(biāo)之一,它可以通過養(yǎng)分生物利用率來(lái)衡量,而篩選植物養(yǎng)分高利用率這一重要指標(biāo)則可以通過養(yǎng)分經(jīng)濟(jì)利用率來(lái)衡量。本文又通過測(cè)算鉀素利用率對(duì)鉀代謝相關(guān)基因表達(dá)水平結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明,高鉀基因型K9、K2、K7、K3和K5在高鉀環(huán)境下鉀素吸收能力強(qiáng)但利用率較低,在低鉀環(huán)境下鉀素吸收能力強(qiáng)且利用率相對(duì)較高,尤其是K2、K7和K9株系的鉀經(jīng)濟(jì)利用率相對(duì)較高。有研究表明,養(yǎng)分利用效率高的基因型作物在養(yǎng)分效率較低條件下能進(jìn)行正常代謝,隨著外界養(yǎng)分供應(yīng)濃度的增加,養(yǎng)分利用效率也會(huì)逐漸下降,貧瘠環(huán)境中植物的養(yǎng)分利用效率普遍較高,但并非生長(zhǎng)介質(zhì)中養(yǎng)分有效性越高,植物養(yǎng)分利用效率就越低,與本文研究結(jié)論一致。這主要是由于植物對(duì)低濃度K+(1mmolL–1)以主動(dòng)吸收為主,是通過載體蛋白來(lái)完成,該吸收機(jī)制被稱為高親和吸收,植物在高濃度K+(1~50mmolL–1)時(shí)的吸收屬K+低親和吸收,主要通過K+通道完成。針對(duì)本文的研究結(jié)果,有幾方面值得探討。中國(guó)煙草基因組計(jì)劃實(shí)施以來(lái),繪制完成絨毛狀煙草(Nicotianatomentosif