枯草芽孢桿菌pb55菌株對(duì)煙草赤星病菌的抑菌機(jī)制

枯草芽孢桿菌pb55菌株對(duì)煙草赤星病菌的抑菌機(jī)制

由鏈格唑引起的虛假煙霧病是明末葉片重要疾病，在中國(guó)的各個(gè)地區(qū)都會(huì)發(fā)生，嚴(yán)重影響了葉片的產(chǎn)量和質(zhì)量。當(dāng)前該病害的防治依賴化學(xué)藥劑,受環(huán)境因素影響大,防治效果不理想,易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留。且主用藥劑菌核凈在煙草生產(chǎn)上連續(xù)使用多年,由于抗藥性產(chǎn)生,防治效果明顯下降。尋找新的替代藥劑或更好的途徑防治煙草赤星病極為重要。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對(duì)多種植物病原菌具有生防作用,通過分泌溶菌酶、嗜鐵素、抗生素等代謝物,直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng),防治煙草赤星病有良好應(yīng)用潛力。但是,有關(guān)枯草芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抗真菌作用研究較少。Compant等報(bào)道枯草芽孢桿菌GBP3菌株對(duì)尖鐮孢(Fusariumoxysporum)引起的枯萎病具有拮抗作用。江木蘭等發(fā)現(xiàn),油菜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BY-2菌株揮發(fā)性物質(zhì),能夠抑制油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌絲生長(zhǎng)。Leelasuphakul等測(cè)定了205個(gè)枯草芽孢桿菌菌株的揮發(fā)物,對(duì)水果綠霉病菌(Penicilliumdigitatum)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用,其中有9個(gè)菌株的抑制率達(dá)80%以上。上述研究表明,枯草芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物與其非揮發(fā)性產(chǎn)物一樣,是一類重要的生防資源,但對(duì)其作用機(jī)制和生防途徑均未做深入研究。在本研究中,作者以煙草赤星病菌作為指示病原菌,系統(tǒng)研究了枯草芽孢桿菌Tpb55菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌、防病及促生效應(yīng),對(duì)尋找煙草赤星病以及其他植物病害生物防治的新途徑和模式進(jìn)行了有益探索。1材料和方法1.1tpb65菌株的制備煙草赤星病菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定,PDA培養(yǎng)基斜面4℃下保存。使用前轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)5～7d(26℃),用無菌水洗下,1500g離心3min去除菌絲,取上清液即為孢子懸浮液,稀釋至103個(gè)/ml,接種前制備最佳。Tpb55菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定,NA培養(yǎng)基斜面4℃下保存,使用前轉(zhuǎn)接到NA平板上活化2次。煙草品種云煙85,托盤育苗,2～4片真葉時(shí)假植到育苗盆(φ10.0cm)消毒土中,備用。1.2揮發(fā)物對(duì)煙草赤星病菌生長(zhǎng)的影響參照江木蘭等方法,將煙草赤星病菌菌塊(φ5.0mm)和Tpb55菌株分別接種在裝有PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中預(yù)培養(yǎng)1d,以不接Tpb55的NA培養(yǎng)皿作對(duì)照,去掉培養(yǎng)皿蓋,將PDA培養(yǎng)皿倒扣在NA培養(yǎng)皿上,用封口膠將2皿交接處密封,26℃培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿平皿時(shí),測(cè)定揮發(fā)物對(duì)煙草赤星病菌的作用。1.2.1Tpb55揮發(fā)物對(duì)赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的影響十字交叉法逐日測(cè)定對(duì)照和揮發(fā)物處理赤星病菌菌落直徑,計(jì)算抑制率。1.2.2Tpb55揮發(fā)物對(duì)赤星病菌菌落性狀及菌落色素形成的形態(tài)學(xué)觀察觀察Tpb55揮發(fā)物對(duì)菌絲生長(zhǎng)、色素產(chǎn)生及孢子產(chǎn)生的影響。1.2.3Tpb55揮發(fā)物對(duì)赤星病菌分生孢子產(chǎn)生的影響將處理與對(duì)照赤星病菌的分生孢子用10.0ml無菌水洗下,用血球計(jì)數(shù)板分別測(cè)定其濃度,然后轉(zhuǎn)化成分生孢子總產(chǎn)量。1.3煙草赤星病菌tpb65菌株的分離培養(yǎng)選容積5L的干燥器,用硫酸調(diào)節(jié)其內(nèi)部濕度為85%。取4～5真葉期煙苗2盆,每盆2株,用接種噴霧器,接種煙草赤星病菌孢子。將活化好的Tpb55菌株接種到PDA平板上,28℃培養(yǎng)24h,去掉皿蓋與2盆煙苗一同置入干燥器中,培養(yǎng)皿置于底部,凡士林封口,28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察記載煙株發(fā)病率和病斑數(shù)。以不接種Tpb55菌株為對(duì)照,每處理3次重復(fù)。1.4煙苗株高、地徑、細(xì)株鮮重測(cè)定方法同1.3。待煙苗長(zhǎng)至20d后,小心將煙苗整株挖出,洗去根部泥土,測(cè)量其株高、最大葉的長(zhǎng)寬、整株鮮重等指標(biāo)。以不接種Tpb55菌株為對(duì)照,每處理3次重復(fù)。2結(jié)果2.1揮發(fā)性抗菌物質(zhì)培養(yǎng)抑菌測(cè)定結(jié)果(圖1)表明,Tpb55在NA培養(yǎng)基上產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制病原真菌生長(zhǎng)。與煙草赤星病菌共同培養(yǎng)1d即有揮發(fā)性抗菌物質(zhì)產(chǎn)生,對(duì)赤星病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)70%以上。處理5d后,病原真菌僅僅向4周伸長(zhǎng)3.0mm,而對(duì)照平板上真菌幾乎覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿,菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)95.0%。2.2赤星病菌病原菌形態(tài)觀察Tpb55菌株揮發(fā)物作用于煙草赤星病菌后,菌絲較稀疏,生長(zhǎng)緩慢,黑色素形成受阻,菌落呈黃色(圖2A);挑菌落置顯微鏡下觀察,赤星病菌菌絲形態(tài)無明顯變化,較透明,但未見有分生孢子(圖2C)。對(duì)照赤星病菌菌絲則致密,生長(zhǎng)旺盛,菌落呈灰褐色,菌絲稍暗,夾雜大量分生孢子(圖2B)。2.3分生孢子檢測(cè)結(jié)果Tpb55菌株揮發(fā)物作用于煙草赤星病菌5d后測(cè)定,所有平板均檢測(cè)不到赤星病菌分生孢子,而對(duì)照分生孢子產(chǎn)量平均達(dá)2.36×107個(gè)/皿。2.4煙苗病斑和病斑數(shù)調(diào)查接種赤星病菌后3d,對(duì)照煙株陸續(xù)開始發(fā)病;接種后5d,對(duì)照煙株全部發(fā)病,病斑主要集中在底部2～3片葉上;接種后10d調(diào)查,對(duì)照煙苗病株率為100%,病斑數(shù)達(dá)8.02個(gè)/株,發(fā)病葉片變黃枯死。Tpb55菌株揮發(fā)物處理煙株全部生長(zhǎng)良好,葉色正常,未見有發(fā)病葉片。2.5tpb54植株的生長(zhǎng)特性促生試驗(yàn)結(jié)果(表)表明,Tpb55菌株揮發(fā)物對(duì)煙苗有較好的促生效果。與對(duì)照相比,Tpb55菌株揮發(fā)物處理煙苗在株高、最大葉長(zhǎng)、葉寬、鮮重等指標(biāo)上顯著增加,增加幅度分別為11.95%、18.49%、11.29%和12.35%。Tpb55菌株揮發(fā)物處理煙苗20d后,與對(duì)照煙苗植株相比,葉色濃綠,葉片肥厚且大,長(zhǎng)勢(shì)更加旺盛。3揮發(fā)性抗菌物質(zhì)生物防治資源是可持續(xù)農(nóng)業(yè)研究與發(fā)展的重要前提,發(fā)展生物防治的新思想、新方法和新技術(shù),提高綜合防治水平,有利于環(huán)境保護(hù)、食品安全、生物多樣性。拮抗微生物是植物病害生物防治的重要因子。微生物產(chǎn)生拮抗物質(zhì)包括非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì),長(zhǎng)期以來,大量植病生防研究集中于微生物產(chǎn)非揮發(fā)性物質(zhì)研究,純化、鑒定了多種抗菌物質(zhì),如細(xì)菌素(bacteriocins)、熒光素(fluorescein)、土壤桿菌素(agrocin)、酚類物質(zhì)、多肽類抗生素(polypeptides)、蛋白質(zhì)類抗真菌素等,并廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治。有關(guān)微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物用于植病生防的研究報(bào)道較少。Vespermann等測(cè)定了9個(gè)細(xì)菌菌株揮發(fā)性代謝物對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用,供試菌株均表現(xiàn)不同程度的拮抗作用,其中枯草芽孢桿菌B2等7個(gè)菌株具強(qiáng)烈抑制作用(80%～99%),證明了拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物病原菌有明顯的影響。本研究結(jié)果表明,對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)95%以上,說明產(chǎn)揮發(fā)性抗菌物質(zhì)是Tpb55菌株重要抑菌機(jī)制之一。揮發(fā)性物質(zhì)的抗真菌作用主要有抑制孢子萌發(fā)或菌絲生長(zhǎng)、孢子形成、子囊的產(chǎn)生和致畸作用。Tpb55菌株揮發(fā)物對(duì)赤星病菌抑制作用主要以抑制菌絲生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)生,對(duì)防止病原菌的侵染和病害傳播具有重要意義。較非揮發(fā)性抗菌物質(zhì),揮發(fā)性抗菌物質(zhì)更易于在土壤或空氣中滲透和擴(kuò)散,能更有效地殺滅病原菌接種體。Leelasuphakul等認(rèn)為芽孢桿菌對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)水果的防治效果主要得益其揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。為了探索微生物揮發(fā)物用于植病生防的途徑,本研究開展了封閉條件下,模擬病害環(huán)境,測(cè)定了Tpb55菌株揮發(fā)物對(duì)煙草赤星病的防治作用。結(jié)果表明,該菌株揮發(fā)物在試驗(yàn)條件下,有效抑制了病害的發(fā)生,防治效果達(dá)100%。生防菌對(duì)寄主植物的影響是判斷其是否具有推廣應(yīng)用價(jià)值的重要依據(jù),此前研究結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌揮發(fā)物對(duì)寄主植物(擬南芥)無不良影響,具促生作用。本文研究結(jié)果與上述研究一致,Tpb55菌株揮發(fā)物對(duì)煙草生長(zhǎng)無明顯毒害作用,且在株高、鮮重等方面較對(duì)照顯著增加。大量研究表明,微生物中產(chǎn)揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的菌株是重要的植病生防資源,具有良好的生防潛力和應(yīng)用前景,但長(zhǎng)期以來相關(guān)領(lǐng)域研究卻受到忽視,生防潛力沒有得到充分的發(fā)掘。本研究為