不同產(chǎn)地連錢草藥材的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究

不同產(chǎn)地連錢草藥材的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究

連草是嘴唇科植物的活血丹（glechoma）kpor干燥的土壤。具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫的功能。主治尿路結(jié)石、疳積、黃疸、感冒、肺癰、咳嗽、小兒驚風(fēng)、跌打扭傷、骨折、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。湖北省民間常用新鮮連錢草治療腹瀉,療效較好,其抗腹瀉作用機(jī)理近年來已得到初步研究。我國連錢草資源極為豐富,除西北和內(nèi)蒙古外,全國各地均有分布。據(jù)報道,測定連錢草中熊果酸和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可控制該藥材質(zhì)量。但這種測定單一成分和有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法并不能全面反映連錢草藥材的內(nèi)在質(zhì)量,因?yàn)橹兴幍乃幮嵌喑煞謪f(xié)同作用的結(jié)果。中藥指紋圖譜不強(qiáng)調(diào)中藥單一指標(biāo)的絕對唯一性,而強(qiáng)調(diào)中藥多成分、多指標(biāo)的整體性及中藥內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性,是現(xiàn)階段可以全面反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的一個有效手段。本文采用高效毛細(xì)管電泳(HPCE)建立了連錢草藥材的指紋圖譜,對4個產(chǎn)地及對照藥材的指紋圖譜進(jìn)行了比較分析,為連錢草藥材的質(zhì)量評估提供了一定科學(xué)依據(jù)。1藥品、化學(xué)品、乙酰氨基酚對照品CAPEL-105型毛細(xì)管電泳儀(LUMEX,俄羅斯),配有可調(diào)波長的UV檢測器和Chrom&Spec1.5X數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);pH計(jì)(上海雷磁公司)。連錢草對照藥材(中國藥品生物制品檢定所,批號121386-200401);對乙酰氨基酚對照品(中國藥品生物制品檢定所);乙醇、乙腈及硼酸(分析純);湖北咸寧和四川產(chǎn)連錢草購于湖北省醫(yī)藥有限公司,湖北武漢和湖北恩施產(chǎn)連錢草自行采集,經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為唇形科植物活血丹(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)的干燥地上部分。2方法和結(jié)果2.1連錢草供試溶液的配制內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取對乙酰氨基酚0.0756g,用乙醇溶解并定容至50mL,搖勻,得10mmol·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。供試溶液的配制精密稱取干燥的連錢草粉末5g,加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇50mL,加熱回流30min,趁熱過濾。重復(fù)提取2次。合并濾液,減壓濃縮,加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5mL,并用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇定容至50mL,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,得供試溶液。其中,內(nèi)標(biāo)物濃度為0.1mol·L-1。2.2測試方法未涂層融熔石英毛細(xì)管50μmI.D.×375μmO.D.,總長62cm,有效長度53.5cm(河北永年銳灃色譜器件有限公司);檢測波長278nm;壓力進(jìn)樣3kPa,15s;電壓25kV;毛細(xì)管溫度25℃;電泳緩沖液:50mmol·L-1硼酸緩沖液(pH9.2),并含有體積分?jǐn)?shù)15%乙腈。毛細(xì)管使用前分別以0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液、重蒸餾水和電泳緩沖液依次沖洗10min、10min、15min,每2次電泳之間用電泳緩沖液沖洗5min。2.3指紋譜的構(gòu)建2.3.1貿(mào)易投資電泳結(jié)果按“2.1”項(xiàng)下方法制備不同產(chǎn)地連錢草藥材的供試溶液,每個產(chǎn)地進(jìn)樣2次,記錄電泳圖,共考察了60min,發(fā)現(xiàn)在20min后沒有電泳峰出現(xiàn)。比較4個產(chǎn)地和對照藥材供試溶液的電泳結(jié)果,以電泳峰的相對遷移時間(電泳峰與對乙酰氨基酚內(nèi)標(biāo)物遷移時間的比值)定性,確定共有指紋峰為16個(見圖1)。不同產(chǎn)地連錢草藥材共有峰的相對遷移時間和相對峰面積(共有峰與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值)見表1。2.3.2指紋圖譜檢測取一份湖北咸寧產(chǎn)連錢草供試溶液,分別在0,1,2,6,8,12h檢測指紋圖譜。以共有峰的相對遷移時間計(jì)算,RSD小于2.6%;以共有峰的相對峰面積計(jì)算,4號峰的RSD為6.4%,14號峰的RSD為5.6%,其余共有峰的RSD均小于5%。說明供試溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.3共有峰相對峰面積和相對峰同時點(diǎn)的rsd取一份湖北咸寧產(chǎn)連錢草供試溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,各共有峰相對遷移時間的RSD小于2.6%,相對峰面積的RSD除4號峰為5.4%外,其余共有峰的RSD小于5%。說明方法的精密度較好。2.3.4目標(biāo)遷移時間和相對峰面積的rsd精密稱取干燥的湖北咸寧產(chǎn)連錢草藥材粉末5份,每份5.0g,按“2.1”項(xiàng)下制備供試溶液,測定其指紋圖譜,各共有峰相對遷移時間的RSD小于2.3%,相對峰面積的RSD除4號峰、14號峰分別為7.2%、6.1%外,其余共有峰的RSD小于5%。說明方法的重現(xiàn)性較好。2.3.5測定樣品峰重疊率指紋圖譜及其峰重疊率5種連錢草藥材的指紋圖譜見圖1和表1。峰重疊率是在2個相互比較樣品的各自峰數(shù)及兩者共有峰數(shù)的基礎(chǔ)上,從質(zhì)的角度考察2個樣品的相關(guān)性。即:重疊率=[待測樣品與對照樣品共有峰數(shù)×2/(待測樣品峰數(shù)+對照樣品峰數(shù))]×100%。將連錢草對照藥材作為對照樣品,求得4個產(chǎn)地連錢草藥材指紋圖譜的峰重疊率分別為49.2%(咸寧),51.6%(武漢),59.2%(四川),60.3%(恩施)。指紋圖譜的8強(qiáng)峰8強(qiáng)峰是指樣品電泳峰中相對峰面積較大的前8個電泳峰,是從量的角度考察不同樣品的差異性。表2是5種連錢草藥材指紋圖譜的8強(qiáng)峰。3電泳峰的分離和測定3.1取相同量的連錢草藥材,以共有指紋峰的相對峰面積之和為考察指標(biāo),對提取方式(蒸餾法,超聲法)、提取溶劑(甲醇,乙醇)、提取時間(30min,60min,90min)、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)(45%,60%,75%,)、提取溶劑體積(藥材重量的6倍,8倍,10倍)和提取次數(shù)(1次,2次,3次)進(jìn)行優(yōu)化,其中后面4項(xiàng)指標(biāo)的優(yōu)化采用正交設(shè)計(jì)法。結(jié)果表明,連錢草藥材用10倍于其重量的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇蒸餾2次,每次30min,提取效果最佳。3.2考察了不同波長處(220nm,254nm,278nm,300nm,325nm)連錢草供試溶液的電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)在278nm處檢測到的電泳峰數(shù)目最多。研究了不同濃度的硼酸緩沖液(10～50mmol·L-1)、磷酸鹽緩沖液(10～50mmol·L-1)、不同pH值(pH5～10)及有機(jī)改性劑體積分?jǐn)?shù)(5%～20%,)對連錢草提取物分離的影響。結(jié)果表明:pH值的改變對分離的影響最大,pH9.2時分離出的電泳峰最多(見圖2);乙腈的加入使電泳峰的峰形及分離情況均得到改善。綜合考慮,確定最優(yōu)電泳條件為:電泳緩沖液為含體積分?jǐn)?shù)15%乙腈的50mmol·L-1硼酸緩沖液(pH9.2);檢測波長278nm;電壓25kV;溫度25℃。3.3從圖1和指紋圖譜的峰重疊率可以看出,不同連錢草樣品的指紋圖譜有一定差別,4種產(chǎn)地連錢草的峰重疊率都偏低,表明連錢草的主要化學(xué)成分種類因產(chǎn)地不同而有較大差異,與對照藥材的差異性從小到大依次為湖北恩施、四川、湖北武漢、湖北咸寧。由表1可見,各共有峰的相對峰面積差別較大,其中15,16號峰的相對峰面積差異最顯著。從表2可見,12號共有峰(St為2.194)均以較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)入8強(qiáng)峰,說明該成分是連錢草的最主要成分之一;5,6,13,14,15,16號共有峰(St分別為1.554,1.717,2.263,2.349,2.536,3.018)均分別在2個連錢草樣品中進(jìn)入8強(qiáng)峰,其中,16號共有峰以較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)入湖北武漢和湖北恩施產(chǎn)連錢草的8強(qiáng)峰,說明該成分也是這兩個產(chǎn)地連錢草的最主要成分之一;4種連錢草的8強(qiáng)峰相對峰面積之和大小不一,四川產(chǎn)最小,湖北恩施產(chǎn)最大,表明連錢草的主要化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)因產(chǎn)地不同而有較大差異,與對照藥材的差異性從小到大依次為湖北咸寧、四川、湖北武漢、湖北恩施,這與主要化學(xué)成分種