2真核基因轉(zhuǎn)錄及加工

真核生物基因轉(zhuǎn)錄RogerD.Kornbergwasawardedthe2006NobelPrizeinChemistry"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription".真核生物基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)用真核生物基因轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：1.轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同類型的RNA有不同的啟動序列；2.多種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的RNA產(chǎn)物；3.多個(gè)調(diào)節(jié)因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；4.轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上分隔，轉(zhuǎn)錄后存在廣泛的加工。

1.RNA聚合酶啟動子、調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性。RNAPolI:rRNA,相對活性50-70%RNAPolII:mRNA,相對活性20-40%miR-RNAPolIII:tRNA,相對活性10%RNAPolIV:smallncRNA,相對活性??真核生物三種RNA聚合酶的比較真核生物的特異DNA序列真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身基因表達(dá)活性的特異DNA序列，稱為順式作用元件(cis-actingelement)。

順式作用元件能夠被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識別和結(jié)合，從而影響基因表達(dá)活性。啟動子(promoter)

順式作用元件又分增強(qiáng)子(enhancer)沉默子(silencer)En/SiProDNA編碼序列轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegeneoctamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsite

determinestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)

bindsSp1(Specificityfactor1)CAATbox(GGCCAATCT)

bindsCTF(CAATboxtranscriptionfactor)Octamer(ATTTGCAT)

bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCATTSS核心元件區(qū)上游調(diào)控區(qū)基因調(diào)控區(qū)：由三部分組成核心元件區(qū)：——決定是否轉(zhuǎn)錄由TATAbox和起始位點(diǎn)（TSS）組成上游調(diào)控區(qū)UPE(UpstreamPromoterElement)

：具多種調(diào)控元件CAAT框、GC框等，含其中一種或多種，決定轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱（轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄起始頻率），啟動子的強(qiáng)弱取決于UPE的類型。確定真正的起始位點(diǎn)遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)更上游；如β–珠蛋白基因的遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)在-1300—-3300間增強(qiáng)子：使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增強(qiáng)的DNA序列，作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)元件。特點(diǎn)：1.增強(qiáng)效應(yīng)明顯（10–200倍）；2.增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)；3.大多為重復(fù)序列，一般50bp；

4.增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性，只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；5.沒有基因?qū)Ｒ恍浴Ｗ饔脵C(jī)制：通過改變模板DNA的整體結(jié)構(gòu)（影響DNA-Pro復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或改變DNA超螺旋密度）eg.形成Z-DNA，增強(qiáng)子才有功能。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激附近的任一啟動子。GenecloneHACNS1增強(qiáng)子HACNS1（又叫CENTG2）是對進(jìn)化有貢獻(xiàn)的一個(gè)基因增強(qiáng)子。如今有證據(jù)顯示在人類基因組發(fā)現(xiàn)的十一萬基因增強(qiáng)子中HACNS1在人類與祖先黑猩猩分道揚(yáng)鑣之后的進(jìn)化過程中變化最大，對人手指和可能改造腳踝以適應(yīng)人類兩腿行走意義。5SrRNA基因內(nèi)啟動子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)啟動子有三種類型：基因內(nèi)啟動子基因外啟動子混合啟動子14Typicalstructureofaneukaryoticgeneenhancerorsilencer5’UTR3’UTR

2.真核基因的調(diào)節(jié)蛋白

反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或間接與順式作用元件相互作用，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式作用因子。按其功能不同，常有以下三類：

基本轉(zhuǎn)錄因子:識別promoter元件轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子:識別enhancer或silencer共調(diào)節(jié)因子：不能進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)相互作用RNA聚合酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBPTATADNATAF:TBPassociatedfactorsholoenzyme（1）基本轉(zhuǎn)錄因子(generaltranscriptionfactor)

是指能夠直接或間接與啟動子核心序列TATA盒特異結(jié)合、并啟動轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白。TBP:TATA-boxbindingproteinTFII:polIIassociatedTF(2)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(transcriptionfactor,TF)

這類調(diào)節(jié)蛋白能識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游序列和遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子元件，通過DNA－蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。決定不同基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá). 轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptionalactivator) 轉(zhuǎn)錄阻遏因子(transcriptionalrepressor)（3）共調(diào)節(jié)因子(transcriptionalregulator/co-factor)首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白－蛋白相互作用，進(jìn)而影響它們的分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,本身無DNA結(jié)合活性。如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用——共激活因子；與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用——共阻遏因子。常見轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域(domain)DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain)鋅指BasicAA(K/R)rich,positivelycharged轉(zhuǎn)錄激活域(trans-activationdomain)TF蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域（dimerization,co-factors）谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域(D/E-rich)脯氨酸(P)富含域堿性亮氨酸拉鏈最常見的DNAbindingdomain鋅指(zincfinger)C——CysH——His常結(jié)合GCbox典型的類固醇激素受體(steroidhormonereceptor)結(jié)構(gòu)示意圖(2ZincfingersintheDBdomain)

堿性亮氨酸拉鏈（bZIP:basicLeuZip)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活因子序列比較

堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活蛋白與調(diào)控區(qū)DNA相結(jié)合的示意圖

bHLH蛋白(basicHelix-Loop-Helix)同源域(Homeodomain)蛋白通過其第三個(gè)螺旋與雙鏈DNA的大溝相結(jié)合，其N端的延伸部分則與DNA的小溝相結(jié)合，提高了穩(wěn)定性

常見的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域

真核基因表達(dá)調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是復(fù)雜的、多樣的網(wǎng)絡(luò)*不同的DNA元件組合可產(chǎn)生多種類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式。*多種轉(zhuǎn)錄因子又可結(jié)合相同或不同的DNA元件。*轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件結(jié)合后，對轉(zhuǎn)錄激活過程所產(chǎn)生的效果各異，有正性調(diào)節(jié)或負(fù)性調(diào)節(jié)之分。真核基因表達(dá)的多級調(diào)控組蛋白修飾DNA甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄后加工mRNA降解蛋白質(zhì)降解蛋白質(zhì)翻譯翻譯后修飾1.染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)主要依賴于輔助調(diào)節(jié)因子對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。輔助調(diào)節(jié)子通過三種方式對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)起調(diào)節(jié)作用：1）依賴于ATP的核小體重建復(fù)合體（ADRC）：它們依靠水解ATP所產(chǎn)生的能量來改變核小體的相對位置，將DNA序列暴露出來，使轉(zhuǎn)錄因子能夠與之結(jié)合。這是一個(gè)物理過程，染色質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)并沒有變化，只改變核小體的相對位置。2）組蛋白修飾：主要通過共價(jià)修飾組蛋白的末端來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。當(dāng)構(gòu)成染色質(zhì)的組蛋白發(fā)生修飾時(shí)，就會影響染色質(zhì)的構(gòu)型，而結(jié)構(gòu)的變化引起基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。3）DNA甲基化：真核DNA約有5%的胞嘧啶被甲基化。一般而言，DNA甲基化抑制基因表達(dá)。

組蛋白發(fā)生修飾，堿基暴露等原因而引起核小體結(jié)構(gòu)改變，使核小體不穩(wěn)定性增加。Sequence-independentlinkerhistones:controlDNAcompactionandaccessibilitytotrans-actingfactorspost-translationalmodificationsofhistonetails:controlcompactionofDNAandserveasdockingsitesfortrans-actingfactorsDNA甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用

甲基化預(yù)測在我們的基因組中，發(fā)生甲基化的DNA影響基因的開關(guān)?；虮磉_(dá)能夠推斷與我們的身份相關(guān)聯(lián)的幾種屬性，如性別、種族、年齡和健康，甚至童年時(shí)代經(jīng)歷。FactorsunderlyingvariableDNAmethylationinahumancommunitycohort.LuciaL.Lama,etal.doi:10.1073/pnas.11212491092.DNA水平的調(diào)節(jié)

真核基因一般都處于阻遏狀態(tài)，RNA聚合酶對啟動子的親和力很低。通過利用各種轉(zhuǎn)錄因子正性激活RNA聚合酶是真核基因調(diào)控的主要機(jī)制。3.RNA水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工：真核基因大多為斷裂基因，內(nèi)含子和外顯子一起被轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物經(jīng)剪接（包括可變剪切,alternativesplicing）、加帽、加尾等加工修飾，才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA。RNA降解：包括非特異性降解（RNase,exosome)和特異性降解(NMD，RNAi)。4.蛋白水平的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成:ribosome蛋白翻譯，構(gòu)像折疊，細(xì)胞內(nèi)定位蛋白質(zhì)修飾:包括磷酸化(phosphorylation),乙酰化(acetylation)，甲基化(methylation),糖基化(glycosylation),etc蛋白降解：包括非特異性降解（protease,peroxisome，vacuole)和特異性降解(Ubiquitin/proteasomesystem,下下次課具體講)。真核基因表達(dá)調(diào)控的主要步驟

染色質(zhì)去組裝蛋白質(zhì)修飾生化功能真核基因轉(zhuǎn)錄后的加工

1.真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特點(diǎn)：含內(nèi)含子，需經(jīng)剪接去除；需要修飾（加帽、加尾，稀有堿基）；轉(zhuǎn)錄和翻譯是兩個(gè)相對獨(dú)立的過程。

2.加工類型:加帽、加尾修飾——甲基化、?；艚覴NA編輯RNA加工的意義：活化——使無活性的前體RNA加工成有活性的成熟RNA；（rRNA、tRNA的剪接、修飾）改變基因的編碼產(chǎn)物——同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，不同剪接方式，編輯方式，蛋白產(chǎn)物不同；調(diào)節(jié)方式——加工會影響RNA的活性、半衰期、運(yùn)輸?shù)龋绊慠NA功能的發(fā)揮；編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因在核漿中被轉(zhuǎn)錄，RNA分子很大，且很不穩(wěn)定，由于大小很不一致，稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），其中mRNA是由hnRNA加工成的。hnRNA25%——mRNA75%——在核內(nèi)降解hnRNA先加帽，hnRNA尾端被切去一段后，加poly（A）尾，切除內(nèi)含子成為mRNA，進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)。加帽(Cap0、CapI、CapII三種帽子結(jié)構(gòu))在細(xì)胞核中進(jìn)行，hnRNA的5’端常為GTP，帽子化過程后，形成m7G5’ppp5’Np結(jié)構(gòu)。5’帽子的功能：保護(hù)mRNA免受5’-核酸外切酶降解；使mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；對翻譯起識別作用（m7G5’ppp5’Np優(yōu)先與核糖體結(jié)合）。三種帽結(jié)構(gòu)初級轉(zhuǎn)錄物的切除與多聚腺苷酸化RNAsplicingandediting剪接splicing——把斷裂基因轉(zhuǎn)錄本中的內(nèi)含子除去

真核生物基因是斷裂基因(splitgene)

外顯子(exon)與內(nèi)含子(intron)Alternativepromoters&RNAsplicing-essentiallydisprovedtheoldernotionthatasinglegenesequenceencodedasingleprotein圖8-9可變剪接導(dǎo)致α-淀粉酶基因在不同組織中的表達(dá)差異

內(nèi)含子的剪接方式自我剪接（由RNA分子本身完成）：Ⅰ型Ⅱ型剪接體SnRNP參與——mRNA酶蛋白參與的剪接——tRNASnRNA參與的mRNA前體的剪接自我剪接與剪接體催化的剪接比較InhibitionofRNAHelicaseBrr2bytheC-TerminalTailoftheSpliceosomalProteinPrp8.Science,May232013;DOI:10.1126/science.1237515mRNA的不同剪接產(chǎn)物在某些生物中，在不同分化時(shí)期，RNA種類無區(qū)別，基因表達(dá)差異靠加工實(shí)現(xiàn)，如海膽卵母細(xì)胞。不同剪接方式：產(chǎn)物中少一個(gè)外顯子；產(chǎn)物中外顯子不同；內(nèi)含子保留；5’剪接點(diǎn)改變；3’剪接點(diǎn)改變。剪接錯(cuò)誤造成貧血病RNA編輯(RNAediting)

DNA上不存在，在RNA產(chǎn)物中插入或刪除幾個(gè)堿基的現(xiàn)象。類型：U的插入和刪除；G/C/A的插入（改變其閱讀框）；C—U互變改變密碼子，構(gòu)建終止密碼。

——是基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制RNA的編輯(RNAediting)

大多數(shù)mRNA中缺少適當(dāng)?shù)?、完整的起始密碼，不能正確起始翻譯，經(jīng)編輯后可生成成熟mRNAmRNA甲基化m6A新發(fā)現(xiàn)，20%的人類mRNA中N6-甲基A腺苷(m6A），存在5000多個(gè)不同的mRNA分子中。包括許多人類疾病基因編碼的mRNA中，包括癌癥以及一些大腦疾病，如孤獨(dú)癥、阿爾茨海默病、精神分裂癥。RNA甲基化是一種可逆修飾，參與大量生物學(xué)通路和生理過程。mRNA甲基化缺陷引起疾病。肥胖癥風(fēng)險(xiǎn)基因FTO突變的人m6A水平低下，食物攝入和代謝異常，從而導(dǎo)致肥胖。據(jù)估計(jì)，全球10億人有FTO突變，此突變是肥胖癥及2型糖尿病的主要病因ComprehensiveAnalysisofmRNAMethylationRevealsEnrichmentin3′UTRsandnearStopCodons.KateD.Meyer,etal.doi:10.1016/j.cell.2012.05.003DavidBaulcombeForthediscoveryofRNAinterference–genesilencingbydsRNAandsmallRNAfunctionalRNAtranscripts(tRNA,rRNA,miRNA)

MicroRNAs(miRNAs)canregulategeneexpressionRNAiNatureReviewsMolecularCellBiology8:23–36(2007)siRNAmiRNARNAactsasaregulatorofgeneexpression----genesilencingmicroRNA大多數(shù)的microRNA是通過Drosha將長鏈的原始轉(zhuǎn)錄本剪切成約含有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的65個(gè)堿基的microRNA前體，再由Dicer將其加工為含有約22個(gè)堿基的雙鏈成熟microRNA。成熟的microRNA與Argonaute蛋白復(fù)合體結(jié)合，通過不完全配對靶向mRNA，阻遏翻譯。mse-tsRNAs成熟精子中大量存在一類來源于tRNA的小分子RNA。這類小RNA的長度主要富集于29-34nt，類似但不同于睪丸中的piRNA；命名為mse-tsRNAs(mature-sperm-enrichedtRNAderivedsmallRNAs)。mse-tsRNAs的含量占小鼠精子小RNA測序reads總量的67.54%；mse-tsRNAs在成熟精子頭部富集，說明其能夠在受精時(shí)進(jìn)入卵細(xì)胞,可能作為一種古老的父源信息在受精時(shí)傳遞給卵細(xì)胞。AnovelclassoftRNA-derivedsmallRNAsextremelyenrichedinmaturemousesperm.HongyingPeng,etal.,cellresearch,2012/10/09RNA到RNA的復(fù)制人類細(xì)胞中的所有RNA都從DNA模版復(fù)制.從RNA到RNA的復(fù)制機(jī)制，只存在于植物和酵母菌中，與一種名為RNA依賴性RNA聚合酶（簡稱RdRP）有關(guān)，這種酶參與關(guān)鍵性細(xì)胞調(diào)控程序。研究發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中有數(shù)千種能直接復(fù)制的sRNA。Newclassofgene-termini-associatedhumanRNAssuggestsanovelRNAcopyingmechanism.Philippetal.Naturedoi:10.1038/nature09190Contemporaryconceptofgeneexpressionregulation

InformationencodedinDNAismorecomplexthanpreviouslyrealized:?Alternativepromoters?RNAsplicing?Non-codingrepetitiveDNA?SeparategeneproductswithoverlappingDNAsequences?Antisensegenetranscripts?Multiplegeneproductscombinetoformasingleprotein?Trans-actinggeneenhancerslocatedondifferentchromosomes?GenesalsoencodefunctionalRNAs(non-proteincoding)?RNAbasedinheritancemechanismsAlternativepromoters&RNAsplicing-essentiallydisprovedt