鎘鹽脅迫下牙肝臟全蛋白和差異蛋白質(zhì)的提取、分離和鑒定

鎘鹽脅迫下牙肝臟全蛋白和差異蛋白質(zhì)的提取、分離和鑒定

1蛋白質(zhì)組織化學建立能夠有效提取和分離動植物和微生物組織細胞中的完整蛋白質(zhì)，并確定蛋白質(zhì)的方法是目前開展蛋白質(zhì)組學的技術問題之一。雙向凝膠電泳(2D)和雙向液相色譜分離(2D-LC)技術是目前開展蛋白質(zhì)組學研究的常用分離技術,但前者易受細胞組織內(nèi)干擾物影響,例如核酸、多糖和脂類物質(zhì);而后者在分離過程中,易丟失部分蛋白質(zhì),難獲取全蛋白。目前,組織細胞全蛋白的常用破碎技術有丙酮沉淀法、裂解法、凍溶法和酶解法等。針對生物材料來源不同,優(yōu)化提取組織細胞全蛋白和減少內(nèi)外干擾物是開展蛋白質(zhì)組學必須克服的難題。至今,相關的研究已有大量且詳細的研究報道,但尚未建立一套較為成熟、重復性高和廣譜性好的細胞組織全蛋白質(zhì)提取方法。環(huán)境蛋白質(zhì)組學是目前環(huán)境毒理學中最有挑戰(zhàn)性和前瞻性的領域之一,相關的研究僅僅處于起步階段。環(huán)境蛋白質(zhì)組學能同時篩選與鑒定出由各類重金屬和有機污染物,在單一和聯(lián)合脅迫效應環(huán)境中所誘導的多種蛋白指示物,為揭示復雜的毒理機理和評價危害性提供實驗證據(jù)。本實驗以牙鲆肝臟組織為材料,選用差速離心和雙向凝膠電泳非在線聯(lián)用技術,高效提取和優(yōu)化分離受鎘鹽脅迫前后的牙鲆肝臟全蛋白,為后續(xù)選用蛋白質(zhì)組學技術篩選及鑒定監(jiān)測鎘污染程度及危害性的蛋白質(zhì)標志物提供可信度較高的結果。2實驗部分2.1實驗試劑和測牙設備雙向電泳儀(北京六一儀器廠);REFLEX型MALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國Bruker公司);各類冷凍離心機(貝克曼公司)。載體兩性電解質(zhì)(Amersham公司),pH3～10;胰蛋白酶(Promega公司);基質(zhì)α-氰-4-羥肉桂酸(美國ICN生物醫(yī)學公司);碘乙酰胺(Sigma公司);丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等試劑均購自上海生物工程技術有限公司;勻漿緩沖液:0.25mol/L蔗糖,1mmol/LEDTA,50mmol/LTris-HCl,1mmol/LPMSF(pH=7.4);樣品裂解液:7mol/L尿素,4%CHAPS,2mol/L硫脲,60mmol/LDTT,10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,1mmol/LPMSF,0.5%載體兩性電解質(zhì),0.0002%溴酚蘭。分裝,-20℃保存待用;雙向電泳和銀染方法中所需試劑均參考文獻。實驗所需的牙鲆均購于廈門人工養(yǎng)殖場。使用前,牙鲆需在實驗室馴養(yǎng)一周。實驗前72h開始停止喂食,防止飼料中微量重金屬影響牙鲆的正常代謝。隨機選擇牙鲆10只,并隨機分為實驗組和對照組。實驗組牙鲆置于人工模擬構建的CdCl2(10mg/L)的污染環(huán)境中,繼續(xù)飼養(yǎng)72h。對照組牙鲆置于在人工海水中繼續(xù)飼養(yǎng)。實驗前,選用剪斷脊椎處死方式處理牙鲆,并迅速解剖,獲取牙鲆肝臟,用預冷的磷酸鹽緩沖液直接沖洗,并保存在-80℃以備使用。2.2實驗步驟及步驟取實驗組(受鎘鹽脅迫)5條牙鲆的肝臟(POL)各20g,混合后共100g。對照組的POL取法同上。加入等體積勻漿緩沖液,在冰浴條件下研磨制成勻漿。隨后,以400×g的相對離心力離心10min,去除未磨碎的組織和細胞,收集上清液Ⅰ,備用。選用下列差速離心技術,分步收集蛋白沉淀物,并選用2D進行有效分離,具體實驗步驟(始終維持在4℃環(huán)境下):(1)1000×g沉淀分離:以1000×g的相對離心力離心上清液Ⅰ10min,收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。該沉淀物主要是細胞核,用勻漿緩沖液洗滌兩次,最后收集沉淀樣品備用(-20℃保存,下同);(2)12000×g沉淀的分離:以12000×g的相對離心力離心上清液Ⅱ30min,收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。選用勻漿緩沖液洗滌該沉淀蛋白兩次,最后收集沉淀樣品備用;(3)100000×g沉淀的分離:以100000×g的相對離心力離心上清液Ⅲ30min,收集沉淀蛋白質(zhì)和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多數(shù)蛋白是胞漿蛋白,收集樣品,凍干備用;(4)上述所有收集的蛋白組分分別充分溶解于裂解液中,并選用100000×g的相對離心力離心蛋白樣品10min,分別收集上清液,稱為POL蛋白組分Ⅰ(1000×g沉淀蛋白)、POL蛋白組分Ⅱ(12000×g沉淀蛋白)、POL蛋白組分Ⅲ(100000×g沉淀蛋白)和POL蛋白組分Ⅳ(胞漿蛋白),并用于雙向電泳分離。2.3雙凝膠電泳分離條件2.3.1等電聚焦電泳在上樣之前,參考文獻先進行預電泳。預電泳結束后,換上樣品液,在用Bradford法測定樣品液的總蛋白濃度后,以150μg總蛋白上樣,然后進行等電聚焦電泳。2.3.2sds電泳按照SDS均一膠的配方配置11%膠濃度的凝膠。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上,并在膠條上覆蓋一層含有溴酚蘭的0.5%瓊脂糖,在140V的恒定電壓下進行電泳。待溴酚蘭前沿到達凝膠底端時,停止電泳。2.4蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測參照文獻的銀染方法進行蛋白質(zhì)染色。染色后,利用掃描儀對SDS凝膠板進行透射掃描。選用Melanie4Trial軟件進行凝膠電泳圖譜中的蛋白質(zhì)總數(shù)和差異斑點分析與統(tǒng)計。用REFLEX型MALDI-TOF質(zhì)譜儀獲得各蛋白的肽質(zhì)量指紋圖,采用反射模式、正離子譜測定。激光波長為337nm,質(zhì)譜信號單次掃描累加200次,用BRUKER肽混合物作外標。選用常規(guī)PMF和數(shù)據(jù)庫比對技術直接鑒定差異蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)庫選擇MSDB,檢索基本條件參照文獻。3結果與討論3.1蛋白質(zhì)測定各組anie4t爾雅軟件的蛋白測定結果圖1是牙鲆受金屬鎘脅迫后,采取直接裂解法提取POL全蛋白質(zhì)的2D圖譜。從圖1可看出,實驗組和對照組的蛋白質(zhì)斑點分布趨勢基本一致,具有較好的重現(xiàn)性。采用Melanie4Trial軟件進行蛋白質(zhì)斑點數(shù)目統(tǒng)計與分析,對照組和實驗組2D圖譜中的蛋白質(zhì)斑點數(shù)目約為800個,其中多數(shù)蛋白質(zhì)斑點的pI范圍集中在4.5～9.0之間,蛋白質(zhì)亞基的分子量在25～100kD之間,具有較高的分辨率,適合于后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定。通過比對分析,可獲得11個差異蛋白質(zhì)斑點,其中高表達蛋白2個(A6和A11);上調(diào)蛋白6個(A1、A4、A7、A8、A9和A10);下調(diào)蛋白3個(A2、A3和A5)。這些差異蛋白斑點均與受鎘鹽誘導有關,推測是牙鲆肝臟產(chǎn)生的應激蛋白質(zhì)。3.2差速離心法高效提取牙肝臟全蛋白技術肝臟是動物代謝的重要場所之一,具有各類復雜代謝途徑和含有豐富的蛋白質(zhì)。借鑒文獻,選用2D分離法可獲得約近千個鼠肝臟全蛋白斑點數(shù)的實驗結果。本實驗選用直接裂解法提取POL全蛋白,但只獲取約800個蛋白斑點的2D圖譜。顯然,圖1中的全蛋白質(zhì)斑點數(shù)偏少,不太適合進一步深入開展POL蛋白質(zhì)組學研究,尤其不適合研究鎘鹽毒理學和篩選連續(xù)監(jiān)測流動水體鎘污染程度的蛋白指示物。在系列比對實驗基礎上,建立了差速離心法高效提取牙鲆肝臟全蛋白技術,具體實驗步驟見圖2。圖2顯示了選用差速離心法使牙鲆肝臟中不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)得到粗分離,減少高豐度蛋白的干擾和提高低豐度蛋白富集的效果,有助于開展牙鲆肝臟全蛋白組學研究和篩選差異蛋白質(zhì)。目前,常用于動物肝臟全蛋白質(zhì)提取技術且適合于開展蛋白質(zhì)組學研究方法有TCA/丙酮酸沉淀法、緩沖液法、裂解法及“鳥槍”蛋白質(zhì)組分析法等。但這些方法獲取肝臟全蛋白種類大都低于1500種,明顯少于本實驗建立的差速離心提取技術。3.3蛋白斑線計數(shù)圖3是在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟組分Ⅰ全蛋白和差異蛋白圖譜。采用Melanie4Trial軟件對圖解中的蛋白質(zhì)斑點數(shù)目進行統(tǒng)計與分析,可在亞細胞組分Ⅰ中獲得約380個蛋白質(zhì)斑點。比較圖3A(實驗組)和圖3B(對照組),可獲得11個差異蛋白斑點。其中A1、A2、A3、A4、A6、A7和A8為上調(diào)蛋白,而A5、A9、A10和A11為下調(diào)蛋白。3.4電泳分中獲得的蛋白斑塊圖4是在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟組分Ⅱ全蛋白和差異蛋白的2D圖譜。經(jīng)統(tǒng)計與分析后,發(fā)現(xiàn)亞細胞組分Ⅱ中獲得約550個蛋白斑點。比較圖4A(實驗組)和圖4B(對照組)蛋白斑點分布和差異特性,可獲得13個差異蛋白斑點,其中的A1和A4斑點為上調(diào)蛋白;A2、A3、A6、A7、A8、A9、A11和A12斑點為下調(diào)蛋白;A5、A10和A13為高表達蛋白(highexpressionproteins)。3.5比對分析結果圖5是在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟組分Ⅲ的全蛋白和差異蛋白質(zhì)的2D圖譜。經(jīng)分析與統(tǒng)計,可獲悉圖5顯示出約500個蛋白斑點。比對圖5A和圖5B結果,可進一步獲悉兩圖之間約有14個差異蛋白斑點。其中的A10、A11和A14斑點為上調(diào)蛋白;A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12和A13斑點為下調(diào)蛋白。3.6差異蛋白的篩選及鑒定通常認為,細胞破碎液經(jīng)100000×g的相對離心力離心后所獲得的蛋白上清液視為細胞的胞漿蛋白。根據(jù)3.2節(jié)所描述的實驗步驟和離心率可獲悉,牙鲆肝臟組分Ⅳ屬于胞漿蛋白質(zhì)。在鎘鹽脅迫下,所獲得牙鲆肝臟組分Ⅳ的差異蛋白質(zhì),視為金屬鎘脅迫牙鲆肝臟表達的差異胞漿蛋白。從圖6中可看出牙鲆肝臟組分Ⅳ含有約850個蛋白斑點,其胞漿蛋白質(zhì)種類明顯高于其它牙鲆肝臟組分的蛋白質(zhì)種類,說明了牙鲆肝臟含有豐富的胞漿蛋白質(zhì)。比較圖6A和圖6B中的差異蛋白斑點分布情況和規(guī)律可獲悉,在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟表達了16種差異蛋白,其差異蛋白總數(shù)目多于其它POL組分。其中高表達的蛋白質(zhì)為A1、A2、A4和A9;上調(diào)蛋白為A5、A6、A7、A10、A11和A14;下調(diào)蛋白為A3、A8、A12、A13、A15和A16。進一步選用肽質(zhì)量指紋(PMF)圖譜和數(shù)據(jù)庫比對技術對上述54個差異蛋白進行鑒定。結果發(fā)現(xiàn),有3種同類差異蛋白,即共有51個不同的差異蛋白。在鑒定結果中發(fā)現(xiàn)了一些文獻中已報道的與鎘鹽脅迫有關的蛋白(見表1)。總結圖3～6中所顯示的蛋白斑點數(shù)目可獲悉,選用差速離心法分離牙鲆肝臟的全蛋白種類約2280個,明顯高于直接裂解法(800個蛋白斑點)的結果。雖然選用不同離心力分離POL亞細胞蛋白組分之間含有同一類蛋白,但只發(fā)現(xiàn)存在少量同類蛋白質(zhì),說明了選用差速離心法所獲取的POL全蛋白中只含有少量的同類蛋白質(zhì),推測所獲得的蛋白種類應高于2000種,適合于開展POL蛋白質(zhì)組學研究。在鎘鹽脅迫下,同樣也獲取54種差異蛋白,其中只有3種同類差異蛋白,即鎘鹽脅迫牙鲆肝臟表達了51種差異蛋白,這也適合于篩選潛在的可用于研究金屬鎘毒理學和監(jiān)測流動水體重金屬污染的蛋白質(zhì)指示物。顯然,差速離心結合雙向電泳技術顯著提高了牙鲆肝全蛋白的分離效率和差異蛋白的檢出率。由于動物組織、細胞及卵等中蛋白質(zhì)種類間存在豐度差異,現(xiàn)有的全蛋白提取與分離技術不易通過單一的2D方法同時顯示高低豐度不同的蛋白質(zhì)。而本實驗所建立的差速離心技術結合蛋白質(zhì)組學技術,不僅降低蛋白之間產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象,而且還使許多低豐度蛋白得以富集和鑒定,從中獲取更多的蛋白種類。在蛋白的分離效率上明顯高于現(xiàn)有