葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白glu4的提取純化及晶體結構解析

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白glu4的提取純化及晶體結構解析

glut4分子功能與結構解析葡萄糖運動性蛋白（glcosetransporter4）廣泛存在于高等哺乳動物肌肉和脂肪中。這是一種12倍的糖蛋白。這種參與控制人體葡萄糖的平衡起著重要作用。越來越多的證據(jù)表明，糖蜜4與移植障礙有關。GLUT4在脂肪細胞和肌細胞中表達,胰島素刺激GLUT4分子轉(zhuǎn)移到細胞膜上,促進葡萄糖分子的轉(zhuǎn)運過程。GLUT4分子功能與結構信息對于研究糖尿病的胰島素釋放障礙和胰島素抵抗機制有重要意義。GLUT4蛋白的三維結構解析有助于我們深入了解糖尿病發(fā)生的分子機制,而得到GLUT4蛋白晶體的關鍵是獲得足夠的蛋白產(chǎn)量和純度。目前世界上還尚未有關于體外組織大規(guī)模純化GLUT4的相關報道。本文我們首次嘗試選用較大的哺乳動物作為原材料,采用組織提取方法初步分離和純化了GLUT4。1材料和方法1.1冰上放置時間新鮮豬肉脂肪組織取自于家豬皮下脂肪部位,購買于北京市第五肉聯(lián)廠。為防止組織腐爛,應在冰上放置當天實驗或者-20℃凍存。GLUT4單克隆抗體1F8由DavidE.James博士饋贈。1.2實驗處方1.2.1tis/hc1的研磨法破碎細胞首先,將150g脂肪組織用冰冷的生理鹽水浸泡,除去一些雜質(zhì)和殘留的血液,然后用無菌剪刀將組織剪切成小塊,加入3-5倍體積(約400mL)的預冷勻漿緩沖液(20mmol/LTris/HC1,pH7.4,0.25mol/L蔗糖,1mmol/LEDTA,1μmol/Lpepstatin,1μmol/Lleupeptin),通過切片式勻漿器將組織進一步破碎勻漿成稀糊狀溶液(10次,8s/次)。其次,將稀糊狀勻漿液置于細胞搗碎器的磨沙玻璃筒內(nèi),體積不超過其1/3,將研磨棒緩慢深入勻漿液中,調(diào)速器轉(zhuǎn)速打到最慢,開動馬達,逐步加速到所需速度(3000-4000rpm)。搗碎過程注意維持低溫,筒外可放置冰水浴。最后,脂肪組織通過勻漿和破碎后,將不能分解的油脂用雙層紗布過濾除去。勻漿液置于冰上保存。1.2.2沉淀和上清fps的制備勻漿液用1200g離心10分鐘,以除去未勻漿破碎完全的組織碎片和漂浮液面上的油脂層,收集上清(F)。上清(F)16,000g離心10分鐘,去除上層油脂,收集上清(F1)和沉淀(P1),上清(F1)用48,000g離心30分鐘,收集上清(F2)和沉淀(P2),上清(F2)用210,000g離心50分鐘,收集上清(F3)和沉淀(P3),以上沉淀均用勻漿緩沖液重懸。超速離心機型號為日立CP100-MX。1.2.3硫酸銨提純條件GLUT4通過差速離心分離得到的含GLUT4的上清,約200mL,逐步加入硫酸銨并緩慢攪拌,選取5個硫酸銨濃度梯度范圍0-35%,35%-45%,45%-55%,55%-65%和65%-85%進行初步提純。每一步得到的沉淀通過16,000g離心,并用勻漿緩沖液重懸沉淀。1.2.4單抗轉(zhuǎn)膜制備通過分離純化的各組分樣品通過12%SDS進行分離,然后40V電壓下轉(zhuǎn)膜過夜,脫脂牛奶封閉,依次通過GLUT4單抗1F8和二抗孵育,最后通過堿性磷酸酶法顯色。2結果2.1glut4結構組織的分離和鑒定在基態(tài)下,GLUT4大部分存在于脂肪細胞內(nèi)膜結構組織中。根據(jù)一般內(nèi)膜組織提取實驗證實,在44,000g離心轉(zhuǎn)速下大部分密度較大的膜結構組織,包括質(zhì)膜,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等都被離心沉降,而210,000g離心轉(zhuǎn)速可將大部分的密度小的內(nèi)膜結構組織分離沉降,因此,我們利用內(nèi)膜組織的物理特性選用1200g,16,000g,48,000g,210,000g四個轉(zhuǎn)速來差速分離富含GLUT4的脂肪細胞內(nèi)膜結構組織。我們對每一步差速分離的上清和沉淀進行了SDS和WesternBlot檢測(圖1:A和B)來分析差速分離后的GLUT4定位。根據(jù)WesternBlot檢測,我們發(fā)現(xiàn)在55kDa左右有一條被GLUT4的單克隆抗體1F8特異識別的條帶,并且大小與文獻報道GLUT4蛋白大小相吻合。根據(jù)結果顯示,在差速離心分離的每步組分中都檢測到了GLUT4,而且,最后一步差速分離后得到GLUT4大部分存在于上清F3中。在傳代培養(yǎng)的3T3-1脂肪細胞提取研究中發(fā)現(xiàn)富含GLUT4的內(nèi)膜組織在180,000g離心作用下被分離沉淀出來。通過比較認為,我們在大規(guī)模提取組織細胞中采用了較為劇烈的勻漿研磨過程,脂肪組織細胞中相當多的內(nèi)膜結構遭到破壞,富含GLUT4的內(nèi)膜組織碎片大部分仍游離于上清中(圖1,A:F3)。2.2glut4的純化通過差速離心分離,我們雖然檢測到GLUT4的存在,但是通過SDS顯示,樣品中蛋白成分非常復雜(圖1,A)。為了得到更純的GLUT4,我們選用傳統(tǒng)的硫酸銨沉淀法初步純化了富含GLUT4的F3組分。傳統(tǒng)的硫酸銨分級沉淀法對于GLUT4的純化效果十分顯著。我們發(fā)現(xiàn)在35-55%的硫酸銨濃度范圍內(nèi),GLUT4得到了大量富集純化,同時這一結果得到了WesternBlot的驗證(圖2)。35-55%的硫酸銨濃度范圍沉淀得到的GLUT4約為40mg,通過10mL磷酸緩沖液PBS(含0.5%DM)重懸來測定濃度。純化后的GLUT4在去污劑DM存在下可以穩(wěn)定存在3天。通過對每步硫酸銨分級沉淀得到的蛋白進行定量,得出了在35-55%的硫酸銨濃度范圍內(nèi)沉淀得到的蛋白大約有40mg(表1),得到的GLUT4純度大約由原來的5%上升到50%(圖2,A)。3glut4的純化由于GLUT4是具有12次跨膜結構的內(nèi)在膜蛋白,目前通過融合表達體系表達具有多次跨膜蛋白的方法技術鮮有報道。究其原因,一是膜蛋白很難在體外表達體系中正確折疊和修飾,二是即使表達,蛋白的產(chǎn)量也很難提高,特別是利用真核表達系統(tǒng)的話將耗費相當大的資金。根據(jù)GLUT4在體內(nèi)的功能定位實驗證明,為了可以在胰島素刺激的條件下迅速轉(zhuǎn)運體外血液中的葡萄糖進入細胞內(nèi)代謝,GLUT4蛋白在細胞膜上含有相當可觀的拷貝數(shù),因此我們根據(jù)前人在脂肪細胞和肌肉細胞中GLUT4研究的一些工作為基礎,首次嘗試了利用家豬的脂肪組織作為原材料,利用差速離心方法和硫酸銨沉淀方法初步提取和純化了GLUT4。與在細胞提取或者小規(guī)模組織提取GLUT4不同的是,大規(guī)模組織提取需要在勻漿前利用刀片高速剪切組織,差速離心分離后大部分GLUT4存在于離心上清中,這主要是因為細胞膜的破碎,導致含有GLUT4的小的膜碎片無法沉淀下來。我們在豬脂肪組織的差速離心分離樣品中檢測出較豐富的GLUT4,并且進一步通過硫酸銨沉淀法成功純化了GLUT4,說明脂肪組織是提取純化GLUT4的理想材料。在150g脂肪組織中,于35%-55%的硫酸銨沉淀濃度范圍內(nèi)得到40mg純度達到50%的GL