蝴蝶蘭組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

蝴蝶蘭組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

蝴蝶蘭花也被稱為蝴蝶蘭，它的花形狀奇特，色彩鮮艷，花期長(zhǎng)，具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。它是國(guó)際上最具商業(yè)價(jià)值的四種觀賞熱帶蘭之一。由于蝴蝶蘭屬于單莖性氣生蘭,再生能力弱,很難進(jìn)行分株繁殖,且種子非常細(xì)小,在自然條件下很難萌發(fā),增殖系數(shù)很低,比其他蘭花更難以進(jìn)行常規(guī)的無(wú)性繁殖,不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此,研究蝴蝶蘭的繁殖具有重要的意義。組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑。近些年,出現(xiàn)了不少以蝴蝶蘭的葉片、根尖、莖尖、花梗等外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道,但尚有許多環(huán)節(jié)需要改進(jìn)。蝴蝶蘭組織培養(yǎng)程序一般為:選取外植體(葉片、根尖、莖尖、花梗等)→誘導(dǎo)形成原球莖(PLB)→原球莖大量增殖→分化出小植株→生根壯苗培養(yǎng)→溫室移栽。筆者對(duì)蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述。1蝴蝶蘭的繁殖1.1根據(jù)離體器官，原球莖被誘導(dǎo)生長(zhǎng)1.1.1新培養(yǎng)葉片的原球莖(1)以葉片為外植體。以葉片為外植體誘導(dǎo)原球莖具有取材容易、廣泛、不損害母株等優(yōu)點(diǎn)。Ishii等認(rèn)為,在添加蔗糖的培養(yǎng)基中,以葉片為外植體沒(méi)有原球莖產(chǎn)生,葉片誘導(dǎo)比較困難,一般需要高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。Park等將無(wú)菌苗葉片切成5mm×10mm大小,接種于MS+6!BA15mg/L+NAA1mg/L培養(yǎng)基上,8周后誘導(dǎo)出原球莖。劉林取蝴蝶蘭花莖莖節(jié)在無(wú)菌條件下培養(yǎng)長(zhǎng)成幼枝上的葉片切塊作外植體,在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果表明,培養(yǎng)基中加1mg/LNAA、10mg/L腺嘌呤、10mg/L6!BA、1%瓊脂和2%蔗糖,容易產(chǎn)生原球莖。蔡斌以花梗芽培養(yǎng)所得的無(wú)菌莖芽頂部展開(kāi)的新葉為外植體進(jìn)行培養(yǎng),一個(gè)月后切口邊緣的葉面上有白色的原球莖形成。研究同時(shí)表明,6!BA和KT不能使葉塊誘導(dǎo)出原球莖,而培養(yǎng)基中添加椰子汁有利于葉塊分化出原球莖。馬杰等取市售瓶苗蝴蝶蘭幼嫩葉片,采用不同培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)效果比較。結(jié)果表明,香蕉泥和椰乳(CM)對(duì)蝴蝶蘭外植體原球莖的形成具有明顯的促進(jìn)作用。在MS+6!BA5.0mg/L+NAA2.0mg/L+香蕉泥10.0%+AC0.3%的培養(yǎng)基中,葉片原球莖的誘導(dǎo)率可達(dá)48.6%。Chen等以蒴果授粉萌發(fā)出的幼葉為外植體,接種于MS培養(yǎng)基上,通過(guò)試驗(yàn)得出結(jié)論:當(dāng)1cm長(zhǎng)的葉片接種到附加0.1mg/L和1.0mg/LNAA的培養(yǎng)基上后,外植體幾乎全部死亡,沒(méi)有原球莖產(chǎn)生;當(dāng)添加TDZ后20d,葉片表面即有原球莖產(chǎn)生。因此TDZ對(duì)蝴蝶蘭原球莖的形成有明顯的促進(jìn)作用。(2)以根為外植體。以根為外植體誘導(dǎo)原球莖的報(bào)道較少。黃恩平、張?jiān)品謇煤m實(shí)生苗根段在MS培養(yǎng)基上附加KT和NAA誘導(dǎo)出原球莖,誘導(dǎo)率為9.7%。張秀清等取蝴蝶蘭實(shí)生苗的根尖接種于培養(yǎng)基上,經(jīng)過(guò)50d培養(yǎng)后,在頂端長(zhǎng)出原球莖,其誘導(dǎo)率在75%左右。李進(jìn)進(jìn)等用蝴蝶蘭新發(fā)生的根尖接種于B5+NAA1.5mg/L+CM150ml/L+3%蔗糖培基養(yǎng)上,2周后,根端切口處開(kāi)始膨大,產(chǎn)生淡綠色瘤狀愈傷組織,并不斷擴(kuò)大,成功誘導(dǎo)出原球莖。徐文華等以試管苗的氣生根為外植體,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+NAA1.0mg/L+Ad10mg/L,附加不同濃度的6!BA和CW20%,試驗(yàn)結(jié)果表明,根尖幾乎沒(méi)有誘導(dǎo)出原球莖。(3)以莖尖為外植體。莖尖是細(xì)胞分裂最旺盛部分,成功率較高。潘學(xué)峰、黃鳳嬌以海南蝴蝶蘭試管苗莖尖為外植體,接種于MS、KC、VW3種培養(yǎng)基上,得出結(jié)論:KC培養(yǎng)基效果最好,平均誘導(dǎo)率為77.1%,其次是VW,最差是MS。單獨(dú)使用生長(zhǎng)素NAA也不能產(chǎn)生原球莖;最好的配比6!BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L,原球莖的誘導(dǎo)率高達(dá)90%。王芳等以蝴蝶蘭小幼苗莖尖為外植體,接種在MS附加激素培養(yǎng)基上,培養(yǎng)25~30d,僅在低濃度下誘導(dǎo)出原球莖,6!BA0.5mg/L最好,誘導(dǎo)率40%。張偉等取新長(zhǎng)出的莖尖為外植體,接種在N6培養(yǎng)基上,培養(yǎng)20d后,在不含IAA的培養(yǎng)基中,莖尖組織不能誘導(dǎo)生成原球莖;當(dāng)KT為1.0mg/L、IAA為0.5mg/L時(shí),原球莖的誘導(dǎo)率為100%。張?jiān)獓?guó)在碩士論文中提到:莖尖相對(duì)其他外植體誘導(dǎo)率較高,達(dá)88.5%,最佳激素組合為MS+6!BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L。(4)以花梗為外植體。(1)直接以花梗為外植體。劉福林等將花梗切成約1.5~2.0mm的薄片,平放在固體培養(yǎng)基MS+6!BA1~2mg/L上,培養(yǎng)2周左右,可見(jiàn)外植體膨大,2個(gè)月后,圓球狀的突起增多,長(zhǎng)成桑果狀原球莖,誘導(dǎo)率可達(dá)77%。魯雪華等以花梗節(jié)間段為外植體,接種后約30d開(kāi)始出現(xiàn)膨大,2個(gè)月后有原球莖形成。同時(shí)得出結(jié)論:減少M(fèi)S中大量元素和部分微量元素及有機(jī)成分,適當(dāng)增加少量葉酸和生物素有利于原球莖的形成。在培養(yǎng)基中添加椰乳汁能夠明顯增加原球莖的發(fā)生率。最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基+6!BA5.0~7.5mg/L+NAA0.5~1.0mg/L+椰乳汁15%。陳勇等以盆栽苗的花梗切片為外植體,在常用的多種培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)花梗切片MS+10mg/LKT+5mg/LNAA培養(yǎng)基上有少量原球莖誘導(dǎo)產(chǎn)生。(2)以由花梗芽萌發(fā)的無(wú)菌苗離體器官為外植體。秦凡等將花梗切成帶腋芽的小段,接種于培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,6!BA在濃度為5.0mg/L時(shí)萌發(fā)效果最好,然后將無(wú)根苗去葉取莖尖誘導(dǎo)原球莖,得出莖尖誘導(dǎo)以M1+6!BA3.0為最佳。張?jiān)獓?guó)等將休眠的花梗腋芽啟動(dòng),在三角瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)成無(wú)菌植株,利用無(wú)菌植株的莖尖、葉子、根尖等誘導(dǎo)原球莖狀體進(jìn)行快速繁殖。結(jié)果表明,培養(yǎng)基MS+6!BA3.0mg/L出芽率最高,可達(dá)90%;MS+6!BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L誘導(dǎo)率最高,可達(dá)100%。張啟香等通過(guò)誘導(dǎo)殘敗花梗上的休眠芽萌發(fā),以萌發(fā)的幼葉和去莖尖的莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),并篩選出最佳培養(yǎng)基組成:MS+6!BA3.0mg/L+ZT0.5mg/L+檸檬酸30mg/L;MS+6!BA5.0mg/L+檸檬酸30mg/L+30%椰乳。曹修才等取新抽出的花梗為外植體,接種到培養(yǎng)基上,40d后各種培養(yǎng)基的花梗腋芽都能萌發(fā),再利用葉片誘導(dǎo)原球莖,得出最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6!BA10.0mg/L+NAA1.0mg/L,原球莖誘導(dǎo)率為85%。1.1.2培養(yǎng)基對(duì)植物基因型的影響葉曉青等以繁殖系數(shù)為指標(biāo),在不同激素水平的MS培養(yǎng)基上,對(duì)蝴蝶蘭原球莖的繁殖進(jìn)行研究。結(jié)果表明,在激素水平6!BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L的培養(yǎng)基上,繁殖系數(shù)達(dá)4倍以上;NAA對(duì)原球莖的增殖有維持作用;5%的低質(zhì)量濃度椰乳也有利于原球莖增殖。周俊輝等就添加1~7mg/L6!BA和1mg/LNAA的MS、1/3MS和改良KC3種基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,改良KC的效果最好,1/3MS的效果次之,MS的效果最差。在改良KC基本培養(yǎng)基中,加入6!BA的濃度以1mg/L對(duì)原球莖增殖的效果最好,隨6!BA濃度的增加原球莖增殖率下降。劉曉燕等以原球莖為外植體進(jìn)行培養(yǎng),比較不同基本培養(yǎng)基、有機(jī)添加物和植物激素等因子對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖效果的影響。結(jié)果表明,以改良VW為基本培養(yǎng)基對(duì)促進(jìn)原球莖增殖的效果優(yōu)于MS基本培養(yǎng)基,在MS為基本培養(yǎng)基時(shí),削減大量元素的用量有利于PLB的增殖。使用有機(jī)添加物對(duì)原球莖增殖有影響,其中以椰乳增殖效果最好,6!BA及NAA的使用濃度決定PLB繼續(xù)增殖或分化的方向以及進(jìn)行的速度。葉小曲在碩士論文中提到將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中,通過(guò)正交試驗(yàn)得出原球莖增殖最佳培養(yǎng)基G3+6!BA10.0mg/L+NAA1.0mg/L+活性炭0.2%。Tsu!Hwie等把原球莖切割成2cm×2cm小塊進(jìn)行增殖,增殖培養(yǎng)基為KC+蛋白胨1g/L+蘋果酸30mg/L+椰汁150mg/L,同時(shí)添加2%海藻糖或蔗糖以及1g/L活性炭。結(jié)果表明,在添加海藻糖的固體培養(yǎng)基上,原球莖的增殖率是添加蔗糖的2倍多,同時(shí)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)比在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得更高的增殖率。1.1.3培養(yǎng)基和糖液p、vw快速增殖原球莖并誘導(dǎo)分化成苗是實(shí)現(xiàn)蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵。何松林等以蝴蝶蘭原球莖為材料,比較不同基本培養(yǎng)基、不同碳源和不同培養(yǎng)基添加物對(duì)蝴蝶蘭原球莖幼苗分化的影響。結(jié)果表明,以NP和VW為基本培養(yǎng)基時(shí),原球莖分化幼苗優(yōu)于MS培養(yǎng)基;3種培養(yǎng)基添加物中,椰子汁和馬鈴薯優(yōu)于香蕉;3種碳源相比較,蔗糖有利于苗的分化和生長(zhǎng)。王芳等通過(guò)研究激素對(duì)蝴蝶蘭原球莖分化的影響,得出結(jié)論,6!BA與NAA組合配比為2∶1時(shí)分化率達(dá)最高值100%。姚麗娟等通過(guò)試驗(yàn)得出分化率則以VW最高,達(dá)57%;NAA濃度對(duì)原球莖增殖分化的影響均不明顯。徐曉薇等以蝴蝶蘭花梗誘導(dǎo)的原球莖為材料,對(duì)其進(jìn)行研究,結(jié)果表明,較高的蔗糖含量(6%)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合(6!BA0.01mg/L+2,4!D0.1mg/L)能有效促進(jìn)原球莖的分化。1.1.4研究生根的誘導(dǎo)生根在培養(yǎng)基中添加蘋果汁、香蕉汁、椰乳、土豆泥、低濃度的生長(zhǎng)素和多效唑可促進(jìn)生根壯苗。胡海英、王建宇將原球莖定植于KC+NAA0.2mg/L+5%馬鈴薯+10%椰乳的培養(yǎng)基上,15d后,其根分化出來(lái),并生長(zhǎng)健壯。Wang等將原球莖轉(zhuǎn)接在添加0.1mg/LIAA的培養(yǎng)基上,14d形成根,生根誘導(dǎo)率為40%。楊建國(guó)在碩士論文研究中得出:單獨(dú)使用NAA0.5mg/L為好;隨著6!BA濃度的增高,生根率反而下降;誘導(dǎo)生根較為理想的濃度比為6!BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L,生根率高,根數(shù)多,根長(zhǎng)。李麗等選取NAA、IBA兩種植物生長(zhǎng)物質(zhì)和蔗糖3個(gè)因子,每個(gè)因子取3個(gè)水平,用正交設(shè)計(jì)研究生根試驗(yàn)。結(jié)果表明,NAA對(duì)蝴蝶蘭生根的影響較大,蔗糖次之,而IBA的影響最小,得出蝴蝶蘭無(wú)根苗生根的最佳培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.2mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖20g/L。1.2種子原球莖的誘導(dǎo)蘭花種子的萌發(fā)有兩種方法,即共生萌發(fā)與非共生萌發(fā)(無(wú)菌播種)。無(wú)菌播種適于大多數(shù)熱帶氣生蘭的種子萌發(fā)。姚麗娟等通過(guò)對(duì)蝴蝶蘭雜交種子進(jìn)行無(wú)菌播種培養(yǎng),得出改良KC培養(yǎng)基是適合蝴蝶蘭種子發(fā)芽、生育的最佳培養(yǎng)基;添加10%的椰乳或香蕉汁,對(duì)種子萌發(fā)均有促進(jìn)作用,椰乳效果好于香蕉汁。丁峰等取蝴蝶蘭不同品種成熟蒴果中的種子進(jìn)行無(wú)菌播種,誘導(dǎo)形成原球莖狀球體。結(jié)果表明,對(duì)各供試成熟蒴果種子的誘導(dǎo)均獲成功;最適于種子原球莖產(chǎn)生的培養(yǎng)基為花寶1號(hào)+6!BA3mg/L+NAA0.05mg/L+10%~15%香蕉汁,種子萌發(fā)率高達(dá)95%。范五成等取生長(zhǎng)120d的蒴果,播種于MS+6!BA1mg/L+NAA0.1mg/L+AC2mg/L的培養(yǎng)基中,70d左右可出苗,出苗率達(dá)100%。陳超等通過(guò)對(duì)種子播種方法的比較,得出稀釋法結(jié)果較好,種子分布均勻,且原球莖發(fā)育健壯整齊。1.3叢生芽的誘導(dǎo)誘導(dǎo)不經(jīng)過(guò)愈傷組織直接誘導(dǎo)叢生芽,是蝴蝶蘭快速繁殖的又一個(gè)途徑。劉榮維等通過(guò)花梗腋芽誘導(dǎo)叢生芽,著重研究增殖和壯苗培養(yǎng)。結(jié)果表明,隨著6!BA濃度的提高,叢生芽增殖率上升;添加椰汁有利于增殖率的提高,而且長(zhǎng)勢(shì)較好;適當(dāng)增加培養(yǎng)室光照并加入香蕉和土豆等有機(jī)物能促進(jìn)根系生長(zhǎng),使蝴蝶蘭苗更健壯。祁素萍在碩士論文研究試驗(yàn)中通過(guò)花梗腋芽誘導(dǎo)叢生芽,結(jié)果表明,在MS+6!BA5.0mg/L+NAA1mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高,達(dá)50%左右;在生根培養(yǎng)中,MS+活性炭0.6g/L培養(yǎng)基的生根效果最好,生根量多,且根粗壯。潘學(xué)峰等誘導(dǎo)花梗休眠芽轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)芽,結(jié)果表明,花梗芽在培養(yǎng)基MS+6!BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L上能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽;在叢生芽增殖階段,以6!BA12.5mg/L+NAA0.05mg/L的增殖效果最好;在生根階段以1/2MS+NAA0.5mg/L+0.2%活性炭+10%椰子水的生根效果較佳,生根率可達(dá)100%,且植株生長(zhǎng)健壯。王玉英等研究表明,KT能降低培養(yǎng)基的褐化程度,而1/2MS+6!BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+8%香蕉泥最有利于蝴蝶蘭叢生芽的增殖,增殖率高,且葉片健壯;1/2MS+NAA1.0mg/L+8%香蕉泥有利于促進(jìn)生根。2培養(yǎng)基及光照對(duì)植物基干和外植體總酚含量的影響外植體褐變是植物組織培養(yǎng)中遇到的重要問(wèn)題。有研究表明,導(dǎo)致褐化的主要原因是由多酚氧化酶作用于天然底物酚類物質(zhì)形成醌而引起的,通過(guò)加入抗氧化劑和吸附劑可較好地控制褐化現(xiàn)象發(fā)生。姚麗娟等認(rèn)為,在培養(yǎng)基中添加1~2g/L活性炭,適時(shí)切除培養(yǎng)物的褐化部分,及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,能有效地抑制外植體褐變死亡的發(fā)生;培養(yǎng)基中加入10%椰子水,能促進(jìn)原球莖的生長(zhǎng),減少原球莖增殖過(guò)程中的褐變。劉真華等系統(tǒng)研究了吸附劑(活性炭、聚乙烯基吡咚烷酮PVP)與檸檬酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、維生素C和硫代硫酸鈉5種抗氧化劑對(duì)蝴蝶蘭組培中褐化的影響。結(jié)果表明,活性炭能有效控制褐化和促進(jìn)生長(zhǎng),但不利于分化;谷胱甘肽200mg/L控制褐化的效果雖不及活性炭,但綜合效果最佳,既能較好地抑制褐化,又能促進(jìn)生長(zhǎng)和分化。許傳俊等通過(guò)培養(yǎng)基及光照對(duì)蝴蝶蘭葉片外植體褐變的影響試驗(yàn)結(jié)果表明,蝴蝶蘭葉片外植體在MS紙橋培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d發(fā)生褐變率較低,MS、B5和