多花黃精組培快繁體系的建立

多花黃精組培快繁體系的建立

黃精是百合科多年生草本植物的黃精。它可以補充精華（p.王子ii）和黃鼠尾（p.c.yrtonema）的根，具有潤肺陰虛、補充中度補氣、益腎和填充粘液的功效。近代研究表明,黃精含有煙酸、醒類、豁液質(zhì)、淀粉、二氨基丁酸、黃精多糖及低聚糖等成分,有麻醉及降低動物血壓的作用,對腎上腺素引起的血糖過高有抑制作用,對防止動脈粥樣硬化及肝臟脂肪浸潤、對改善腎臟功能也有較好功效。黃精還是一味抗菌良藥,對傷寒桿菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌及皮膚癬菌等均有一定抑制作用。近年來,本品已廣泛應用于冠心病、高血壓、糖尿病、肺結(jié)核、再生障礙性貧血,以及預防放療、化療引起的副作用等,取得了較好的療效。隨著市場需求量不斷增加和野生資源不斷減少,黃精人工栽培已成為市場供求之主體。黃精繁殖方式主要是有性繁殖(種子)和無性繁殖(根莖)兩種方式。由于黃精種子難收集,種子發(fā)芽率低,而且種子繁殖,育苗時間又長,這樣就大大增加了黃精的栽培成本,不利于黃精的人工大面積種植。所以在當前的人工栽培中,繁殖主要依靠根莖的無性繁殖,但該方法繁殖系數(shù)低,種根莖用量大,既不經(jīng)濟,又限制了黃精的產(chǎn)量潛力,不便栽植管理推廣。因此,黃精種苗問題成了人工大面積種植的瓶頸。而現(xiàn)有黃精栽培基地的黃精品種也迫切需要對其進行提純復壯,以培育高產(chǎn)抗病脫毒的種苗。關于黃精的組織培養(yǎng),徐忠傳、徐紅梅等學者已做過研究。徐忠傳等以黃精根莖段芽端為外植體,在附加6-BA4.0mg/L和NAA0.2mg/L組合的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)可得到無根根莖芽;再將其在附加NAA0.5mg/L的MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng),生根率可達百分之百。徐紅梅等以黃精根莖萌發(fā)形成的不定芽橫切片為外植體,研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑對多花黃精芽體外發(fā)生過程中性狀的影響。認為,多花黃精的體外快速繁殖可通過以下途徑實現(xiàn):TDZ1.5mg/L和2,4-D1.0mg/L的組合誘導不定芽,6-BA(1.0～2.0)mg/L和NAA(1.0～2.0)mg/L的組合誘導健康葉片的發(fā)育,1/2MS+(NAA,IBA,IAA)或2,4-D(0.5～1.0)mg/L誘導生根;6-BA2.0mg/L和2,4-D(1.0～2.0)mg/L的組合用于繁殖以藥用器官為目的的塊莖生長。徐紅梅等所做研究只涉及不同激素及其配比對黃精離體繁殖增殖階段的影響,并無生根、煉苗及移栽的介紹。徐忠傳等以黃精根莖段芽端為外植體的繁殖方法雖然包含全過程,但相關數(shù)據(jù)不具體;比如一個外植體經(jīng)繼代增殖后可得到多少不定芽以及經(jīng)生根、煉苗、移栽后可得到具體種苗的數(shù)量等。而這些數(shù)據(jù)對黃精種苗生產(chǎn)實現(xiàn)工廠化至關重要。此次試驗主要借鑒徐忠傳、徐紅梅等的經(jīng)驗,對黃精的繁殖從無菌體系到種苗這一過程進行系統(tǒng)研究。所得數(shù)據(jù)以期直接供生產(chǎn)實踐應用,從而促進黃精種苗的工廠化生產(chǎn)。1材料和方法1.1材料表面多花黃精帶芽根莖(采自貴州貴陽野生黃精)。1.2方法1.2.1醇沖洗、除硬將黃精根莖從土中挖出,洗去泥土。(1)用刀切取帶芽根莖于洗潔精水溶液中浸泡5min,然后用自來水沖洗干凈;(2)用75%乙醇擦洗表面,再用自來水沖洗干凈;(3)洗潔精水浸泡5min,自來水沖洗60min。(以下步驟在超凈工作臺中完成)(4)75%乙醇0.5min→滅菌去離子水涮洗兩次→2.5%次氯酸鈉5min→滅菌去離子水涮洗2次→2.5%次氯酸鈉5min→滅菌去離子水涮洗2次→2.5%次氯酸鈉5min→滅菌去離子水5次→取出用無菌濾紙吸干水份,用刀切去傷口壞死部分準備接種。1.2.2多元有利條件下的多元分離培養(yǎng)基的篩選將消毒好的黃精帶芽塊莖接于以MS為基本的培養(yǎng)基,選取不同濃度的6-BA、NAA、2,4-D的外源激素進行配比(表1),從中篩選出最佳不定芽誘導培養(yǎng)基。1.2.3外源激素配比將黃精不定芽接于以MS為基本的培養(yǎng)基,選取不同濃度的6-BA、NAA、2,4-D、GA3的外源激素進行配比(表2),以獲得健壯的大量黃精再生苗,并從中篩選出最佳不定芽增殖與壯苗培養(yǎng)基。1.2.4最佳生根培養(yǎng)基的篩選將黃精再生苗接于以MS為基本的培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA、2,4-D、IBA的外源激素進行配比(表3、表4),從中篩選出最佳生根培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均附加3%的蔗糖、0.5%瓊脂、pH5.8～6.0,在121℃下滅菌20min。培養(yǎng)條件(25±1)℃,1600lx,連續(xù)光照12h/d條件下培養(yǎng)。1.2.5基質(zhì)的接種與栽培將已生根的黃精帶芽根莖敞口煉苗3d,然后取出用自來水沖去瓊脂,栽種到基質(zhì)(珍珠巖與蛭石2∶1混合)中。每隔7d施用1次營養(yǎng)液,30d后統(tǒng)計成活率。2結(jié)果與分析2.1不同處理工藝的時間后感染由于采用黃精的帶芽根莖,不可避免會在其表面附著許多雜菌,采用常規(guī)的滅菌方法污染較嚴重。延長滅菌時間,外植體損傷較重,不利于增殖。實驗發(fā)現(xiàn):在沖洗黃精后,用75%的酒精充分擦洗根莖表面;再采取次氯酸鈉滅菌3次,每次5min的多次短時滅菌法,污染較少。雖然延長了滅菌時間,但降低了滅菌劑對外植體的損傷。2.2黃精斑塊的增殖滅菌后將黃精塊莖接于表1的1、2號培養(yǎng)基培養(yǎng),30d后外植體均明顯膨大,獲得大量的無菌材料。將膨大的外植體切成0.25cm2小塊接于表1中的1～4號培養(yǎng)基,培養(yǎng)30d后統(tǒng)計結(jié)果見表1。表1結(jié)果顯示,4種培養(yǎng)基都能誘導黃精塊莖增殖,但只有在含2,4-D的培養(yǎng)基中能在增殖的同時分化出不定芽(見圖1);在含NAA培養(yǎng)基中雖有分化但分化率低,而且每塊外植體分化出的不定芽極少。所以生長素2,4-D比NAA更適合誘導黃精不定芽的分化,濃度為0.2mg/L的分化率高。2.3黃精的增殖分化將分化有不定芽的塊莖切成直徑0.5cm大小接于不定芽的增殖與壯苗的培養(yǎng)基培養(yǎng)。45d后統(tǒng)計的生長結(jié)果見表2。從表2可知,在5～8號培養(yǎng)基和13～16號培養(yǎng)基中,隨著6-BA濃度增加,芽點增殖也增加,但芽越來越小,證明高濃度6-BA有利于黃精的增殖分化。生長勢上,添加生長素為2,4-D的培養(yǎng)基中的長勢好于添加NAA的培養(yǎng)基。從整體上看,在其它條件相同的情況下,加GA3的培養(yǎng)基比不加GA3的培養(yǎng)基分化增殖明顯減少,但是芽長高明顯;隨著6-BA濃度的增加分化增殖也增加,但不定芽高度有所下降。說明GA3與6-BA相互抑制,同時GA3有使植物長高的作用;但12號培養(yǎng)基分化突然減小,且形成較多粗壯無根苗(圖2)。因此,6-BA與GA3之間并不是單純的抑制作用,而是一個復雜的生理作用過程,其機制尚待進一步研究。另外,從黃精組織塊體積增殖水平看,除5、9、13、17號培養(yǎng)基增殖明顯少外,其它均在10倍左右。因此,黃精塊莖的增殖6-BA的含量應不低于1.0mg/L。2.4-ba和2,4-d的生根將得到的粗壯無根苗(同帶芽根莖)單個切下,接于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng),45d后統(tǒng)計的生根結(jié)果見表3。從表3可以知道,生根率都不高。其中21、22、23號培養(yǎng)基上的無根苗在整個過程中芽點未長大,且大多枯萎,下端塊莖有少量長大,變綠;根是在無根苗基部變綠后從綠色塊莖表面長出(圖3);在24、25、26號培養(yǎng)基開始時芽點長高長大,30d后才開始枯萎,但枯萎的只是最開始形成的葉片,而長出的地上莖仍然生長良好(圖4),在60d后可達到10cm以上。由于在增殖培養(yǎng)基中,60d后外植體能分化出根,并且地上莖也生長旺盛,但根少且細。因此,在生根實驗中沒有采用徐忠傳等人的NAA生根培養(yǎng)基,而是直接采用2,4-D來進行培養(yǎng)基的篩選。由于在24、25、26號培養(yǎng)基中添加了少量6-BA,在長根的同時地上莖也生長,進而在煉苗后直接得到種苗而不是徐忠傳等人所報道的只獲得生根的根莖,這樣就避免了黃精移栽后要經(jīng)過越冬才能出苗生長的過程。此外,實驗中,也用徐忠傳等的培養(yǎng)基MS+NAA0.5mg/L用于生根,但生根效果不及2,4-D。這與徐忠傳等報道的百分之百生根率不同。推測可能是因為不同地域生長的黃精體內(nèi)所含內(nèi)源激素水平不同所致,這有待進一步研究?？傊?NAA和2,4-D的生根率都不理想。推測生根率不高的原因可能有兩方面。一方面可能是激素的原因,另一方面可能是培養(yǎng)時間不夠。從激素方面講;目前大多組織培養(yǎng)文獻都認為IBA生根效果最好,因此,此次試驗又將2,4-D換為IBA重新進行生根培養(yǎng)基的篩選,30d后統(tǒng)計實驗結(jié)果如表4。從表4可以知道,隨著IBA濃度增加,黃精無根苗生根率、根長及生根數(shù)也隨之增加。在IBA濃度達到0.7mg/L時生根率達95%、每個無根苗長出5.2棵根,平均根長2.0cm(圖5)。在加入6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基中,生根下降,根長及生根數(shù)也減少,但無根苗長高,形成的根也較粗壯(圖6)。此次生根實驗結(jié)果表明,IBA比2,4-D、NAA更適合誘導黃