麥角固醇合成抑制劑對番茄紅素生物合成的影響

麥角固醇合成抑制劑對番茄紅素生物合成的影響

番茄紅素是一種脂肪性調(diào)理性疾病，具有重要的自由基、抗癌、抗癌、心血管疾病、血管疾病等生理功能。目前國內(nèi)外利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素和番茄紅素的的微生物主要有紅酵母和三孢布拉霉菌等。紅酵母相比三孢布拉霉菌雖然發(fā)酵產(chǎn)率低,但屬于飼用微生物,安全性高,發(fā)酵工藝易于調(diào)控是利用紅酵母生產(chǎn)番茄紅素的主要優(yōu)點。紅酵母細(xì)胞中主要的甾醇類物質(zhì)為麥角固醇,具有抑制紅酵母細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的14α-去甲基酶(將羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為麥角固醇)的活性。麥角固醇缺乏、羊毛甾醇和其他14α甲基固醇的堆積,使真菌細(xì)胞膜的通透性、膜結(jié)合酶活性(如內(nèi)源性呼吸)和角質(zhì)素合成異常,從而提供更多的法尼基雙磷酸酯(FPP)用于紅酵母細(xì)胞中另一聚異戊二烯類物質(zhì)——類胡蘿卜素的合成,使得類胡蘿卜素生物合成量增加。類胡蘿卜素合成過程中,番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素的關(guān)鍵酶是β環(huán)化酶,抑制番茄紅素環(huán)化可以積累大量的番茄紅素。本文主要研究了不同麥角固醇生物合成抑制劑在紅酵母RY-17發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素過程中的應(yīng)用,同時研究了該抑制劑與β環(huán)化酶同時添加對發(fā)酵的影響。1材料和方法1.1蘑菇紅酵母RY-17,中國藥科大學(xué)生化教研室保存。1.2主要設(shè)備和試劑1.2.1氟康唑注射液N-甲基嗎啉、十二環(huán)嗎啉,分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;嗪氨靈,分析純,昆山泰達化學(xué)有限公司;氟康唑注射液,江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司;酮康唑片劑,西安楊森制藥有限公司;番茄紅素對照品,Sigma公司。酮康唑水溶液的制備:取酮康唑片劑0.5g,加入水定容至5ml,溶解過濾滅菌后待用。1.2.2型離心沉淀機隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;LXJ-2型離心沉淀機,上海醫(yī)用分析儀器廠;SW-CJ-IF超凈工作臺,蘇凈集團;721分光光度計,上海第三分析儀器廠;SPD-10A型高效液相色譜儀,島津公司。1.3培養(yǎng)基%斜面培養(yǎng)基(%):葡萄糖2,蛋白胨2,酵母膏1,瓊脂2,自然pH值。搖瓶種子培養(yǎng)基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,酵母膏1,自然pH值,裝液量40ml/250ml瓶。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖4,蛋白胨1,酵母膏1,自然pH值,裝液量80ml/500ml瓶;將菌種26℃活化48h后,接至搖瓶種子培養(yǎng)基中,在26℃振蕩培養(yǎng)約28h,然后按10%接種量接入搖瓶中,在26℃,220r/min振蕩培養(yǎng)72h。1.4生物量的測量取發(fā)酵液50ml,在4000r/min離心20min,稱重。1.5色素提取液的制備采用酸熱法破壁提取,取發(fā)酵液5ml,加入1.5ml鹽酸(10mol/L),室溫振蕩浸泡1h,沸水浴5min,冰浴,以4000r/min離心20min,洗滌1次,加入乙酸乙酯5ml,室溫下振蕩提取30min,4000r/min離心20min,上清液即為色素提取液。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將色素提取液用0.2μm的微孔濾膜過濾后,以高效液相色譜法(HPLC)測定提取液中番茄紅素的含量。同時配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在相同條件下測定,根據(jù)峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。高效液相色譜條件:流動相為乙腈∶二氯甲烷=21∶4;檢測波長為472nm;體積流量1.0ml/min;進樣量為20μl。2結(jié)果2.1麥角固醇對胡蘿卜素生物合成的影響在紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素過程中加入麥角固醇合成抑制劑,考察麥角固醇合成抑制劑對番茄紅素代謝過程的作用。結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,和Ⅰ比較,Ⅱ加入麥角固醇合成抑制劑后,可以使β胡蘿卜素生物合成量明顯增加;從Ⅲ可以看出加入β-環(huán)化酶抑制劑,番茄紅素的進一步代謝為β-胡蘿卜素的過程被抑制;同時添加麥角固醇合成抑制劑和β-環(huán)化酶抑制劑可以使番茄紅素得到積累,產(chǎn)量提高。2.2麥角固醇合成酶抑制劑對類胡蘿卜素合成的影響在發(fā)酵的不同時間加入酮康唑溶液5ml/L,總發(fā)酵時間72h,菌體的類胡蘿卜素生物合成量與酮康唑加入時間的關(guān)系如圖2所示:從圖2可見,隨著酮康唑加入時間的延長,菌體干重呈現(xiàn)上升的趨勢,類胡蘿卜素合成量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在24h處有一個較大的上升。發(fā)酵早期添加麥角固醇合成酶抑制劑會抑制菌體的生長,菌體生物量明顯下降,影響類胡蘿卜素的合成;在發(fā)酵后期添加,無法提供更多的FPP用于類胡蘿卜素的合成。實驗表明抑制劑最佳加入時間為24h左右。2.3不同劑量對紅酵母生長和番茄紅素合成的影響在發(fā)酵24h時加入不同劑量的麥角固醇抑制劑,總發(fā)酵時間72h,考察不同劑量的十二環(huán)嗎啉(Dodemorph),嗪氨靈(Triforine),酮康唑(Ketoconazole),氟康唑氟康唑(Fluconazole)對紅酵母生長以及番茄紅素合成的影響,結(jié)果如圖3所示:從圖3中可以看出十二環(huán)嗎啉和嗪氨靈對紅酵母生長有明顯的抑制作用,隨著抑制劑添加量的增加,菌體量下降,類胡蘿卜素的合成量呈先增加后略微減少的趨勢,減少是因為發(fā)酵生物量減少;隨著酮康唑的添加菌體和類胡蘿卜素都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;氟康唑?qū)w生長的抑制作用不明顯,類胡蘿卜素的含量呈現(xiàn)增長的趨勢。本實驗十二環(huán)嗎啉,嗪氨靈,酮康唑,氟康唑的最適加入量分別為1.0g/L,2.0ml/L,7.5ml/L和75ml/L,此時類胡蘿卜素產(chǎn)量分別為29.32mg/L,35.76mg/L,47.63mg/L,40.21mg/L。實驗結(jié)果表明酮康唑和氟康唑促進類胡蘿卜素積累效果要優(yōu)于十二環(huán)嗎啉和嗪氨靈。其中酮康唑在發(fā)酵24h添加最多可使紅酵母總色素產(chǎn)量提高173%。2.4n-甲基嗎啉對發(fā)酵的影響在發(fā)酵24h加入5ml/L的酮康唑溶液,在發(fā)酵28h加入不同濃度的β-環(huán)化酶抑制劑N-甲基嗎啉,總發(fā)酵72h,考察不同濃度的N-甲基嗎啉對發(fā)酵的影響,結(jié)果如圖4所示:從圖4可見添加β-環(huán)化酶抑制劑可抑制番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣潞}卜素,隨著N-甲基嗎啉添加量的增加菌體重量呈現(xiàn)下降的趨勢,在10ml/L時抑制菌體生長不利于色素合成;番茄紅素產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。實驗表明N-甲基嗎啉的最好加入量為7.5～8.75ml/L之間,此時番茄紅素產(chǎn)量為24.23mg/L。3環(huán)化酶抑制劑紅酵母生物合成及活性成分變化(1)添加麥角固醇合成抑制劑后,麥角固醇合成量被抑制,紅酵母合成類胡蘿卜素量明顯增加,說明加入適當(dāng)?shù)柠溄枪檀己铣梢种苿┛筛淖兗t酵母代謝途徑。酮康唑和氟康唑要明顯優(yōu)于十二環(huán)嗎啉和嗪氨靈。(2)未添加環(huán)化酶抑制劑時紅酵母代謝生成的主要是番茄紅素環(huán)化后產(chǎn)物(β-胡蘿卜素及γ-胡蘿卜素),添加該酶抑制劑N-甲基嗎啉后產(chǎn)物中環(huán)化產(chǎn)物所占的比例大幅度減少,番茄紅素大量蓄積,說明加入適當(dāng)?shù)沫h(huán)化酶可改變番茄紅素代謝途徑,提高其生物合成量。(3)紅酵母中甾醇類物質(zhì)和類胡蘿卜素的生物合成是通過生物體內(nèi)