內(nèi)生枯草芽孢桿菌b-01對煙草的促生機制及青枯病防治效果

內(nèi)生枯草芽孢桿菌b-01對煙草的促生機制及青枯病防治效果

合成化學農(nóng)藥和化肥的大量使用不僅提高了作物產(chǎn)量，而且對人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了負面影響。應用微生物代替(或部分代替)化肥和農(nóng)藥,越來越受到各國政府和研究者的高度重視。植物內(nèi)生細菌與寄主植物在長期共同進化過程中形成了密切的相互關(guān)系,且生存微環(huán)境穩(wěn)定,成為化肥、農(nóng)藥和其它微生態(tài)制劑的最佳競爭者,其合理應用將減少化學農(nóng)藥造成的環(huán)境污染、提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和有利于保持生態(tài)平衡。目前利用內(nèi)生細菌防治植物病害的報道較多,但兼具抗病和促生作用的內(nèi)生細菌卻鮮見報道。作者從煙草中分離出內(nèi)生枯草芽孢桿菌BacillussubtilisB-001菌株(GenBank登錄號為DQ444283),2003年在湖南桂陽縣、2004年在湖南寧鄉(xiāng)縣的小區(qū)防治試驗中均對煙草青枯病具有良好的防治效果。作者測定了該菌株對煙草幼苗的促生作用及其內(nèi)源激素含量的變化,并研究其在煙草植株全生育期的生長動態(tài)以及不同濃度菌懸浮液對煙草青枯病的生防效果,旨為該菌株的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試劑與儀器供試菌株與煙草品種:枯草芽孢桿菌B-001菌株和煙草青枯病菌Ralstoniasolanacarum,由本研究小組分離;煙草種子NC82、云煙87、紅花大金元、翠碧1號、K326、K346,由湖南農(nóng)業(yè)大學煙草研究中心提供。試劑與儀器:乙腈、三乙胺購自美國天地公司;磷酸甲醇等,上海國藥公司產(chǎn)品;赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR4)等激素標樣,購自Fluka公司;測定儀器為Agilent1100高效液相色譜儀、G1314A紫外檢測器;Spherisorb(R)ODS25μm分析柱(4.6mm×250mm)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)柱、二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠(DEAEsephadexA-25)柱、C18Sep-Pak小柱,Waters公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1菌懸浮液的制備將B-001拮抗菌制備牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基種子液后,以5%接種量接種到BPY培養(yǎng)基中(蛋白胨1%、牛肉浸膏0.5%、酵母粉0.5%、葡萄糖0.5%、NaC10.5%,pH為7.0),BPY裝液量為200mL/500mL,30℃、200r/min下振蕩培養(yǎng)96h,制備濃度為1×108cfu/mL的菌懸浮液備用。1.2.2種子長和株高測定分別將NC82、云煙87、紅花大金元、翠碧1號、K326、K346煙草種子浸入B-001菌株的菌懸浮液24h后,分別播種在裝有滅菌菜地土的花盆(直徑20cm)中,每盆20粒種子,每處理5盆,28℃光照培養(yǎng),播種后60天,每盆隨機取10株苗,測定根長、株高、最大葉的長和寬、鮮重。對照為滅菌水處理。1.2.3高效液相色譜法檢測ga3、玉米素核苷的表達將K326煙草種子按1.2.2方法培育,于出苗后15、30、45、60天取整株煙苗,每份15g。將新鮮樣品用棉紗布包好立即放入液氮中處理1~2min,避光條件下真空冷凍干燥,充分干燥后密封放入-70℃超低溫冰箱中保存。準確稱取凍干樣品0.5g,分4次加入預冷的80%甲醇11mL(5+2+2+2),弱光下冰浴中研磨勻漿,于4℃冰箱中浸提過夜(15h)。4℃3000r/min離心20min,倒出上清液,殘渣加入2mL預冷的80%甲醇后旋渦振蕩5min,再3000r/min離心20min,倒出上清液。重復一次上述操作后將殘渣丟棄,合并的上清液進行真空冷凍離心濃縮除去甲醇,加入8mL醋酸銨(0.1mol/L,pH9.0)復溶,10000r/min離心20min,上清液經(jīng)過聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)柱和二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠(DEAEsephadexA-25)柱,以C18Sep-Pak小柱分別收集細胞分裂素類激素和酸性激素,以50%甲醇將C18Sep-Pak小柱中的激素洗脫至樣品瓶,真空冷凍離心濃縮至干,用100μL20%的乙腈溶解進行液相色譜分析。吲哚乙酸、赤霉素的色譜測定條件為起始2%乙腈、100%磷酸溶液,60min后17%乙腈、83%磷酸溶液,73min后30%乙腈、70%磷酸溶液,流速為1mL/min;檢測波長:GA3為198nm、IAA為212nm,根據(jù)外標法定量。脫落酸、玉米素核苷的色譜測定條件的起始濃度為零乙腈、100%三乙胺溶液,30min后15%乙腈、85%三乙胺溶液,流速為1mL/min;檢測波長:ABA為262nm、ZR4為270nm,根據(jù)外標法定量。1.2.4種子水浸劑為b-400誘變菌株的制備參照周燕等方法進行B-001菌株的誘變與接種菌的回收。K326煙草種子用B-001誘變菌株的菌體懸浮液浸種24h,按1.2.2方法培育,以滅菌水浸種為對照。分別于播種后90、120、150、180、210天取煙草根、莖、葉部組織各1g,進行B-001菌株回收。1.2.5煙草青枯病菌感染試驗在溫室內(nèi)用淋根法接種無菌煙草苗,處理組每株煙草淋30mLB-001菌液,濃度分別為1×107、1×108、1×109、1×1010cfu/mL,淋根15天后,淋煙草青枯病菌,以煙草青枯病菌淋根為對照。每處理30株煙草。處理后第20天調(diào)查發(fā)病情況。分級標準參照文獻進行。2結(jié)果與分析2.1菌液處理對煙草幼苗生長的影響B(tài)-001菌株的浸種結(jié)果表明,B-001菌株對不同品種煙草幼苗均有明顯的促生作用,與對照相比,菌液處理組煙草幼苗根長、株高、葉長、葉寬和鮮重分別增長17.64%~25.53%、27.27%~36.00%、42.16%~48.71%、26.53%~42.85%和43.01%~57.70%(表1)。2.2出芽后30daba含量的變化B-001菌液處理后1~60天,煙草K326中IAA、ZR4、GA3的含量增加;但ABA的含量卻始終低于對照,出芽后30天表現(xiàn)最為明顯,較對照低60.60%(圖1)。B-001菌株處理煙草后引起煙草植株體內(nèi)促進生長的內(nèi)源激素含量增加,抑制生長的內(nèi)源激素含量下降,促進了煙草植株的生長。2.3各部位菌量及葉部菌量B-001菌液接種K326后90~150天內(nèi),植株根部的菌量增加至6.27×105~341×105cfu/gFW,莖部的菌量增速較快,菌量達3.84×105~2480×105cfu/gFW,葉部的菌量增速較慢,菌量為0.156×105~12.5×105cfu/gFW;接種150天后,根、莖、葉內(nèi)的B-001菌株菌量均表現(xiàn)明顯的下降趨勢(表2),表明在煙草生長前期該菌在煙草植株內(nèi)的生存能力較強。2.4不同濃度b-400液對煙草青枯病的防效試驗結(jié)果顯示,1×107、1×108、1×109、1×1010cfu/mL的菌懸浮液對煙草青枯病的防治效果分別為50.3%、62.8%、70.2%、70.3%(表3)。表明不同濃度B-001內(nèi)生菌液對煙草青枯病均有一定防效,隨著菌液濃度的增加防治效果有所提高,但當菌量達1×109cfu/mL以上時,防治效果無顯著差異。因此,B-001菌株濃度為1×109cfu/mL時,對于煙草青枯病已達到了較好的防治效果。3芽孢桿菌b-400在煙草植株中的生長特性蔡學清等研究認為,內(nèi)生菌的促生作用主要通過產(chǎn)生吲哚乙酸以及赤霉素等植物激素來促進植物生長。本研究結(jié)果表明,經(jīng)內(nèi)生細菌B-001菌株處理后,寄主植物煙草體內(nèi)與生長有關(guān)的激素如IAA、GA3等含量增加,但抑制植物生長的激素如ABA含量下降,這與上述報道基本一致。植物內(nèi)生細菌的密度與植物的基因型、植物組織、生長階段和環(huán)境條件有關(guān)。芽孢桿菌B-001菌株在煙草植株中的數(shù)量,隨植株的不同器官及不同生長期而異。接種90天后,植株根部的菌量為6.27×105cfu/gFW,而植株莖部的菌量為3.84×105cfu/gFW,其原因可能是該菌從植株根部入侵,且根部的生境更利于其生存。芽孢桿菌B-001菌株在煙草植株中的群體數(shù)量也隨植株的生育期不同而異,從苗期至旺長期,該菌株在植株內(nèi)的數(shù)量逐步提高,旺長期達到最高點;成熟期菌量下降。煙草植株體內(nèi)芽孢桿菌B-001的群體數(shù)量變化的原因可能是煙草植株在開花期生理活動最旺盛、合成的營養(yǎng)物質(zhì)最多、B-001菌株在植株體內(nèi)可以獲得充分的營養(yǎng),此時的菌量最多;而煙草植株成熟期,體內(nèi)的營養(yǎng)向果實輸送,植株體內(nèi)的B-001菌株得不到充足的營養(yǎng)物質(zhì)而菌量減少。另外在煙草生長后期氣溫高,菌體繁殖力下降、休眠菌體上升、數(shù)量減少,可能與B-001菌株本身的生物學特性有關(guān)。Chen等研究表明,