蘆丁與血清白蛋白的結(jié)合作用

蘆丁與血清白蛋白的結(jié)合作用

立法及藥物作用機制黃酮類化合物廣泛存在于中藥和植物中。它是一種具有廣泛藥理活性的天然化合物。蘆丁(Rutin)3’,4’,5,7-四羥基黃酮-3-蕓香糖苷,又名蕓香苷、紫槲皮苷,是槲皮素的3-O-蕓香糖苷(結(jié)構(gòu)式見圖1),天然植物槐米等中藥的有效成份,屬于黃酮類化合物,具有維生素P樣的作用。據(jù)醫(yī)書記載,槐花有多種醫(yī)藥保健功能,如《日華子木草》中說槐花“治五痔、心疼、眼疾”。蘆丁是臨床上廣泛使用的具有高效抗炎作用的藥物,具有維持血管抵抗力,降低其通透性,減少脆性等作用,其在臨床上主要用于防治腦溢血,高血壓,視網(wǎng)膜出血和治療慢性氣管炎等疾病。血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì),不僅對維持滲透壓起重要作用,而且能與進入血液中的大部分內(nèi)源性和外源性物質(zhì)如藥物等進行可逆的結(jié)合從而起到在體內(nèi)轉(zhuǎn)運的作用。藥物與白蛋白的親和力大小也影響到藥物在體內(nèi)的分布、清理以及通過改變血液或組織中游離藥物濃度來影響藥效。因此,研究藥物與血清白蛋白的結(jié)合作用對理解藥物的作用機制具有重要意義。關(guān)于研究蘆丁與血清白蛋白作用的紫外-可見光譜和熒光光譜法已有報道,本文在此基礎(chǔ)上,進一步用熱力學(xué)法研究蘆丁與血清白蛋白的作用機制,得出了蘆丁與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合過程的基本熱力學(xué)參數(shù),為蘆丁在體內(nèi)的儲存、運輸、作用機理及臨床試驗提供有用的信息。1實驗部分1.1實驗試劑和儀器LS-55熒光分光光度計(美國PerkinElmer公司),pHS-25型酸度計(上海第二分析儀器廠),TB-85型恒溫器(日本島津公司),牛血清白蛋白(BSA)為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品,人血清白蛋白(HSA)為華蘭生物工程股份有限公司產(chǎn)品,蘆丁(Rutin)為sigma公司產(chǎn)品,用無水甲醇配成1.0×10-3mol·L-1儲備液,配制10mmoL·L-1Tris-HCl緩沖溶液,pH7.38(內(nèi)含0.15moL·L-1NaCl,維持離子強度),實驗用水為去離子二次蒸餾水,其余試劑均為分析純。1.2蘆丁存在的熒光光譜在一系列10mL的比色管中,加入一定體積的BSA(HSA)溶液,然后依次加入不同體積的蘆丁溶液,以pH7.38Tris-HCl緩沖溶液定容,在λex=280nm,λem=348nm處掃描BSA(HSA)熒光光譜及BSA(HSA)在蘆丁存在下的熒光光譜。2結(jié)果與討論2.1熒光光譜2.1.1靜態(tài)符合動態(tài)加強的特性蛋白質(zhì)分子中因含有三種芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。當(dāng)某些小分子如藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合后,會導(dǎo)致其熒光強度下降,這種現(xiàn)象稱為熒光猝滅作用。由圖2可知,隨著蘆丁濃度的增加而BSA(HSA)體系的熒光強度逐漸降低,表明蘆丁與BSA(HSA)之間發(fā)生了結(jié)合作用從而猝滅了BSA(HSA)的熒光。由于BSA(HSA)溶液的體積(5mL)遠遠大于所滴加的蘆丁溶液的體積(≤100μL),所以可忽略稀釋效應(yīng)。熒光猝滅過程通常可以分為動態(tài)猝滅作用和靜態(tài)猝滅作用兩類。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程。其作用過程遵循Stern-Volmer方程F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)F0/F=1+Κqτ0[Q]=1+ΚSV[Q](1)其中F0為未加猝滅劑時的熒光強度;F為加入猝滅劑后的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù);τ0為沒有猝滅劑存在時熒光分子的平均壽命;KSV稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù),是雙分子猝滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比率;[Q]為猝滅劑的濃度。靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時生成不發(fā)光的配合物,從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強度降低的過程,此過程可用下式描述F0/F=1+K[Q](2)F0/F=1+Κ[Q](2)式中F0,F和[Q]與(1)式相同,K是基態(tài)配合物的形成常數(shù)。比較式(1)和式(2)可以看到,無論是靜態(tài)猝滅還是動態(tài)猝滅,F0/F-1與[Q]之間存在著線形關(guān)系(見圖3)。各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞速率常數(shù)為2.000×1010L·(mol·s)-1,τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命τ0約為10-8s。從表1可知,蘆丁對HSA和BSA熒光的猝滅過程速率常數(shù)都大于最大擴散控制的速率常數(shù),初步判斷此猝滅過程為形成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。溫度升高將增大分子擴散系數(shù),從而增大發(fā)生碰撞猝滅的可能性,但在表1中,動態(tài)猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而減小了,這表明蘆丁對HSA和BSA的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅,而是生成了Rutin-HSA(BSA)復(fù)合物,進一步證明蘆丁對HSA和BSA的熒光猝滅作用是靜態(tài)猝滅,并且該復(fù)合物隨著溫度的升高而穩(wěn)定性下降,從而導(dǎo)致了該復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而降低。2.1.2蘆丁與bsa和hsa的反應(yīng)的力學(xué)性質(zhì)在靜態(tài)猝滅作用中,熒光強度與猝滅劑的關(guān)系可由靜態(tài)猝滅公式表示。logF0?FF=logKA+nlog[Q](3)logF0-FF=logΚA+nlog[Q](3)由式(3)以lg(F0-F)/F對lg[Q]作圖可得一條直線,通過斜率和截距求出蘆丁與BSA和HSA分子的結(jié)合常數(shù)KA(見表1,KA即K)及結(jié)合位點數(shù)n(見表2)。本文所求得的結(jié)合常數(shù)與文獻報道的形成常數(shù)(Rutin-BSA,1.25×106和Rutin-HSA,1.67×106)有一定差別。當(dāng)溫度變化不大時,結(jié)合反應(yīng)的焓變ΔΗ可看成一個常數(shù),由以下熱力學(xué)公式可求得蘆丁與BSA和HSA反應(yīng)的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)(見表3)。lnK2/K1=ΔH(1/T1?1/T2)/R(4)ΔG=ΔH?TΔS=?RTlnK(5)lnΚ2/Κ1=ΔΗ(1/Τ1-1/Τ2)/R(4)ΔG=ΔΗ-ΤΔS=-RΤlnΚ(5)反應(yīng)的ΔG<0,從熱力學(xué)角度來看,證明該結(jié)合反應(yīng)能夠自發(fā)進行;反應(yīng)的ΔΗ<0,為放熱反應(yīng),升高溫度將不利于其向生成rutin-HSA(BSA)復(fù)合物的方向進行。這與靜態(tài)結(jié)合常數(shù)顯示的310K時的KA值比295K時的KA值小相符合。熒光能量轉(zhuǎn)移可分為輻射能量轉(zhuǎn)移和非輻射能量轉(zhuǎn)移,若發(fā)生輻射能量轉(zhuǎn)移,會導(dǎo)致物質(zhì)的熒光光譜畸形。圖2中HSA和BSA的熒光光譜都沒有畸變,因此HSA(BSA)與藥物蘆丁之間的能量轉(zhuǎn)移不應(yīng)為輻射能量轉(zhuǎn)移。非輻射能量轉(zhuǎn)移包括分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移和分子間能量轉(zhuǎn)移。若供能體與受能體結(jié)合生成了復(fù)合物,則兩者之間的能量轉(zhuǎn)移為分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移,否則為分子間能量轉(zhuǎn)移。由上述分析可知,HSA(BSA)與蘆丁之間的能量轉(zhuǎn)移應(yīng)屬于分子內(nèi)的非輻射能量轉(zhuǎn)移。2.2分子間相互作用力討論了22和37℃的水溶液中藥物蘆丁與HSA和BSA的結(jié)合作用。有機小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、氫鍵、VanderWaals力和靜電引力等。不同分子與蛋白質(zhì)結(jié)合力的類型是不同的。根據(jù)文獻,當(dāng)反應(yīng)的焓變ΔH>0,熵變ΔS<0時,分子之間的相互作用力來自于靜電作用和疏水作用力;反應(yīng)的焓變ΔH<0,熵變ΔS<0時,分子之間的相互作用力來自于范德華力、氫鍵或質(zhì)子化等作用力;ΔH≈0,ΔS>0時,可能為疏水作用力;ΔH<0,ΔS>0時,可能為靜電引力;由實驗結(jié)果的熱力學(xué)參數(shù)值判斷蘆丁與HSA和BSA之間的作用力主要為范德華力、氫鍵。3蘆丁與牛血清白蛋白的作用力本文研究結(jié)果表明,蘆丁對牛勛清白蛋白和人血清白蛋白的熒