內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)鑒定方法及其生物學特性

內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)鑒定方法及其生物學特性

內(nèi)陸祖細胞（epcs）在肉芽組織形成、腫瘤血管生長、四肢和心肌缺血過程中形成新血管，促進血液循環(huán)和傷口的恢復。目前,體外分離培養(yǎng)EPCs方法眾多,主要有差速貼壁篩選法、梯密度離心法、流式細胞儀分選法及免疫磁珠分選法等。梯密度離心法和差速貼壁篩選法操作簡便,費用低,對儀器要求不高,但細胞純度相對較低。免疫磁珠法及流式細胞儀分選法能獲得純度較高的EPCs,但操作較為復雜,費用也較高,對細胞有一定的損傷,分選獲得的細胞數(shù)量少,只能針對單一細胞表型,不能分選多種細胞表型的細胞群,絕對純化某一抗原陽性的EPCs必然會丟失另一部分來源的EPCs。此外,EPCs的誘導分化還需要特定的微環(huán)境,可能還需要許多生長因子,包括細胞之間通過接觸傳遞某種信號或分泌的某些因子。因此,本實驗擬結合梯密度離心法與差速貼壁法分離大鼠骨髓單核細胞,然后使用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基EGM-2-MV-SingleQuots進行體外培養(yǎng)、純化、擴增并鑒定,以期為構建組織工程血管、創(chuàng)傷修復、血管新生提供EPCs種子細胞來源。1材料和方法1.1細胞培養(yǎng)和sq1pe-小鼠、vegfr-2、sch3的抗凝劑、sq-射線pe-小鼠、c-ifSD大鼠40只,雄性,3~4周齡,體質量(84.00±6.13)g,由中科院上海實驗動物中心提供。EGM-2-MV-SingleQuots培養(yǎng)基,PE-小鼠抗CD34單克隆抗體,FITC-小鼠抗血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)單克隆抗體,FITC-小鼠抗CD133單克隆抗體,SW-CJ-IF凈化工作臺,恒溫CO2培養(yǎng)箱,Olympus倒置相差顯微鏡,TCSSP2激光共振焦顯微鏡。1.2細胞培養(yǎng)和增殖采用頸椎脫臼法處死大鼠,置于75%乙醇浸泡消毒5~8min,無菌PBS溶液沖洗。在超凈臺上將大鼠固定于無菌解剖臺上,取下大鼠完整的股骨和肱骨,浸泡在含有PBS的培養(yǎng)皿中。剪開兩端骨骺皮質層,顯露骨髓腔,用1mL注射器吸取PBS反復沖洗骨髓腔直至骨質呈白色,吹打均勻制成細胞懸液,吸管吸取,沿試管壁緩慢滴加于含等比例的淋巴細胞分離液液面上,2000r/min,離心30min。吸管吸出懸浮在上、中層界面處的中間云霧層(單核細胞層),置于另一個50mL離心管中,加5倍體積的PBS,混勻,1000r/min,離心10min。重復洗滌2次,棄上清,加入EGM-2-MV重懸細胞?；靹蚝笥嫈?shù),以1×106/mL密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。48h后將上清液中未貼壁細胞移入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。分別觀察48h內(nèi)和48h后貼壁細胞的細胞形態(tài)和增殖能力。待細胞融合約80%時傳代。傳代后計數(shù)上述兩組的平均細胞數(shù)。1.3細胞形態(tài)觀察從首次接種后24h開始,每日于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并采集圖像。1.4內(nèi)陸祖細胞的鑒定1.4.1細胞激活和凝集素1ficilact取第2代EPCs,胰酶消化后收集,調整單細胞懸液密度為105~106/mL,重懸于孔底部放有蓋玻片的6孔板中進行細胞爬片,培養(yǎng)3d;棄上清,PBS洗滌3次,每孔加入1mL培養(yǎng)基和2.5μLDil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h;2%低聚甲醛固定細胞20min,每孔再加入1mL培養(yǎng)基和10μLFITC-UEA-1(FITC標記的凝集素-1),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h;取出細胞爬片,防粹滅劑中性樹脂封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察,采集圖像。顯示紅色熒光為吞噬了Dil-ac-LDL的EPCs,顯示綠色熒光為結合FITC-UEA-1的EPCs,雙染陽性為橙色熒光,為正在分化的EPCs。1.4.2熒光標記檢測pe-cd33取第2代EPCs,用胰酶消化制成單細胞懸液,計數(shù)并調整細胞密度為105~106/mL,分裝成3個EP管,第1管加入10μLPE-小鼠抗CD34單克隆抗體和10mLFITC-小鼠抗CD133單克隆抗體,第2管加入10μLPE-小鼠抗CD34單克隆抗體和10μLFITC-小鼠抗VEGFR-2單克隆抗體,第3管加入PE-小鼠IgG二抗作為同型對照。3管同時置于4℃避光孵育60min,PBS清洗2次,各管分別加入2%低聚甲醛500μL,固定45min,流式細胞儀檢測。以488nm氫離子綠光為激發(fā)波長檢測PE-CD34,以633nm氫離子紅光為激發(fā)波長檢測FITC-VEGFR2及FITC-CD133,每次計數(shù)5000個細胞,流式細胞儀分析熒光標記陽性細胞的比例。陽性率=各抗體相應象限數(shù)值-對照組相應象限數(shù)值,每組設3個樣本,結果取平均值。1.4.3細胞收集分離取第2代EPCs,胰酶消化后收集制成單細胞懸液,1000r/min,離心5~7min,棄上清收集細胞;2.5%的戊二醛4℃固定過夜,用0.1mol/LPBS(pH=7.0)漂洗樣品2次,每次30min,1%鋨酸溶液4℃固定樣品30min,丙酮梯度脫水、浸透、包埋、超薄切片、鉛染色等步驟處理后,透射電鏡下觀察并采集圖像。2結果2.1第1代細胞增殖首次接種后24h內(nèi),單核細胞呈小圓形,懸浮在培養(yǎng)液中。48h內(nèi)貼壁細胞胞質少,呈長梭形,細胞胞體較大,部分胞體融合,含有大量成纖維樣細胞,呈漩渦樣排列;經(jīng)傳代培養(yǎng)2次后,細胞形態(tài)以梭形為主,單層細胞融合成纖維樣結構。48h后貼壁細胞以短梭形為主,也有三角形、多角形及紡錘形,培養(yǎng)7d后有明顯干細胞集落出現(xiàn),細胞胞質多,胞核小,集落中間的細胞為圓形,周邊為梭形,呈出芽生長,這種結構類似于血島,呈放射狀排列。平均每代生長周期為3~5d,細胞增殖至第6代未見明顯衰老。第6代以后,細胞開始逐漸接近于內(nèi)皮細胞,呈典型的鋪路卵石樣外觀,并出現(xiàn)管腔樣結構。見圖1。2.2dil-ac-ldl及胞膜的制備激光共聚焦顯微鏡結果顯示,EPCs胞質攝取Dil-ac-LDL呈紅色,胞膜結合FITC-UEA-1呈綠色,雙染色陽性細胞呈橙黃色,為正在分化的EPCs。見圖2。2.3epcs陽性率結果見圖3,圖3a為加入小鼠IgG二抗作為同型對照組,雙陽性表達量極少,約1.1%。圖3b示第2代EPCs,CD34陽性率70.2%,CD133陽性率74.8%,雙陽性率69.3%。圖3c示第2代EPCs,CD34陽性率38.8%,VEGFR-2陽性率59.8%,雙陽性率39.2%。2.4胞器的檢測透射電鏡觀察結果顯示,EPCs表面有大量球狀、指狀或絨毛狀突起,胞質內(nèi)含有大量細胞器,包括線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質網(wǎng)和質膜小泡等,表明細胞代謝旺盛。此外,可見到內(nèi)皮細胞特征性細胞器———Weible-Palade(W-P)小體,呈桿狀,外附包膜,橫切面可見細桿呈漩渦狀排列,縱切面內(nèi)有大量平行的細管包埋于基質中。見圖4。3討論3.1epcs的功能1997年Asahara等首次報道,人體外周血CD34+單核細胞可被動員到血管損傷處,具有向成熟內(nèi)皮細胞分化的能力,不僅在胚胎期參與血管生成,而且在出生后還參與新生血管的形成。EPCs存在于骨髓、胚胎組織及臍帶血中,以骨髓中的含量最高,且增殖能力強。骨髓單核細胞成分復雜,包括淋巴細胞、間質細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮祖細胞等。本實驗中我們?nèi)?周齡的大鼠骨髓約1mL,經(jīng)過約4周培養(yǎng),可分離出足夠數(shù)量的內(nèi)皮祖細胞,細胞總數(shù)達106以上,能夠滿足后續(xù)研究的需要。3.2胎牛血清因子的培養(yǎng)在EPCs分離培養(yǎng)過程中,首先,掌握適當?shù)膯魏思毎x心速度是關鍵。離心速度過快容易損傷細胞,細胞碎片增多,成活率降低,離心過慢則會使單核細胞與其他細胞相互混雜,細胞純度降低。本實驗采用2000r/min,離心30min,能最大限度地提高細胞成活率及純度。其次,選用的培養(yǎng)基對EPCs至關重要。培養(yǎng)基中胎牛血清、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-1,人表皮生長因子均不可缺少。其中,胎牛血清的質量及濃度非常重要,濃度最好選用5%~10%,<5%細胞攝取營養(yǎng)不足,生長緩慢,>10%則抑制細胞生長。然后,調整適當?shù)膯魏思毎臃N密度。干細胞的增殖與分化依賴于細胞之間的相互作用,適當?shù)慕臃N密度有利于細胞間相互促進生長,而不至于養(yǎng)分不足或產(chǎn)生接觸抑制。當接種密度為105~106/cm2時細胞貼壁和分化最理想。此外,我們認為采取半量換液要比全量換液更能促進細胞生長,這說明細胞間可能分泌一些未知的細胞因子促進內(nèi)皮祖細胞的生長與分化。最后,細胞的貼壁能力也極其重要。常用的促貼壁物質有纖連蛋白、明膠等,前者可增強細胞間、細胞與基質間的粘連,通過信號轉導途徑調節(jié)細胞骨架的形態(tài),促進細胞鋪展貼壁。但實驗中我們發(fā)現(xiàn),使用提前包被纖連蛋白的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)EPCs,細胞貼壁太緊,消化傳代時胰酶使用量增加且作用時間延長,細胞的損傷增加,細胞的形態(tài)和生物特性均受影響。因此本實驗未使用纖連蛋白預處理細胞培養(yǎng)瓶。3.3骨髓單核細胞的分離純化原代細胞主要通過形態(tài)學觀察、特異性細胞標志、細胞功能等3方面進行鑒定。目前對EPCs的鑒定還存在爭議,內(nèi)皮系標志結合獨特的形態(tài)學和功能特征,是當前多數(shù)學者鑒定這一功能性細胞群的主要方法。(1)細胞形態(tài)觀察:我們在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),48h內(nèi)貼壁細胞在接種第3~5天,呈梭形甚至紡錘形散在分布于培養(yǎng)瓶底,第2~3周時出現(xiàn)生長高峰,第4周開始停止生長,并逐漸衰老死亡,這種細胞即早期EPCs;48h后貼壁細胞在傳代培養(yǎng)第2~4周時呈現(xiàn)典型的鋪路卵石樣表現(xiàn),第4~8周出現(xiàn)對數(shù)生長高峰,呈放射狀生長,出現(xiàn)干細胞集落,可存活12周,此即為晚期EPCs。早期48h內(nèi)貼壁細胞含有基質干細胞、成熟內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和EPCs等細胞成分,而晚期貼壁細胞主要是我們所需要的EPCs。(2)干細胞表面標志抗原鑒定:到目前為止,EPCs缺乏統(tǒng)一的細胞表面標志,在細胞生長的不同階段,表面標志也不相同。目前,普遍認可CD34+、CD133+和VEGFR-2+等是內(nèi)皮祖細胞的主要表面標志。本實驗流式細胞術結果表明,CD133+的表達在造血干細胞或祖細胞的分化過程中逐漸丟失,可見CD133是一種區(qū)分早期EPCs與晚期EPCs的標志。在EPCs分化過程中,CD133表達逐漸降低,而CD34+的表達逐漸升高,并逐步開始表達成熟的內(nèi)皮細胞表面標志,如VEGFR-2、VE-鈣黏蛋白和vWF,表明EPCs逐漸向成熟內(nèi)皮細胞分化。本實驗結果中CD133陽性率先逐漸上升,然后降低,正說明EPCs向成熟內(nèi)皮細胞方向分化。(3)細胞的吞噬功能:除了EPCs,內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等均可吞噬AC-LDL并結合UEA-1,所以熒光雙染法鑒定也并非完全特異。從功能角度進行評估,激光共聚焦顯微鏡鑒定EPCs攝取Dil-acLDL,結合FITC-UEA-1的實驗,說明該細胞具有內(nèi)皮細胞功能。實驗中我們在透射電鏡下觀察EPCs內(nèi)部超微結構發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞特征性細胞器—Weible-Palade(W-P)小體,它是一種外有被膜的桿狀細胞器,存在于代謝旺盛的內(nèi)皮祖細胞中,它多出現(xiàn)在