酮康唑微囊的制備及其藥動學(xué)研究

酮康唑微囊的制備及其藥動學(xué)研究

酮康唑（kcz）是一種廣泛的抗真菌藥物，對局部和全身的真菌病具有良好的治療作用。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),采用復(fù)凝聚法制備KCZ微囊是可行的,且質(zhì)量控制方法簡單,可靠。KCZ微囊體外抗真菌作用良好,與氟康唑片劑相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC檢測兔血漿中KCZ含量的方法,并探討了KCZ微囊口服在兔體內(nèi)的藥動學(xué)過程。1儀器和試劑1.1胰蛋白酶、明膠、阿拉伯膠、甲醛溶液酮康唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所,批號0294-9801),酮康唑原料藥(南京第二制藥廠,批號000603),胰蛋白酶(吉泰科技有限公司進(jìn)口分裝,活性比例1：250),明膠、阿拉伯膠、0.1mol·L-1鹽酸溶液、37%甲醛溶液等均符合藥用標(biāo)準(zhǔn);酮康唑微囊(自制,批號041223),酮康唑片劑(商品名:里素勞,西安楊森制藥,批號011108990),甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。1.2儀器、試劑與儀器UV-2201紫外分光光度計(jì)(日本島津),PHS-3C精密酸度計(jì)(廈門第二分析儀器廠),GS12型電子恒速攪拌器(上海醫(yī)械專機(jī)廠),分析天平(湖南湘儀天平儀器廠),Olympus-BX50顯微鏡。WATERS2695-2696高效液相色譜儀(美國WATERS公司),TG328B分析天平(中國湖南湘儀廠),電子恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。1.3動物家兔,雌雄各半,體質(zhì)量(2.0±0.5)kg,第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。2方法和結(jié)果2.1阿拉伯膠溶液的制備明膠、阿拉伯膠分別用適量蒸餾水溶脹5h,制成溶膠;在阿拉伯膠溶膠中加入處方量的酮康唑粉末混合研勻,制成阿拉伯膠酮康唑混懸液,其粒徑為(2.97±0.18)μm,n=280。55℃水浴條件下,將明膠溶膠與阿拉伯膠混懸液混勻,滴加0.1mol鹽酸溶液,邊加邊攪拌,pH調(diào)至4.1～4.2,顯微鏡下觀察成囊情況,加入30℃蒸餾水(成囊體系體積的2倍),攪拌至室溫。冰水浴條件下加入適量37%甲醛溶液使其固化,勻速攪拌1h,滴加20%氫氧化鈉溶液,調(diào)pH至8.0～9.0。靜置分層,棄去上清液,抽濾、低溫干燥,即得。2.2kcz微囊的質(zhì)量控制2.2.1斷裂KCZ微囊為白色或類白色粉末,在顯微鏡下觀察到的微囊形態(tài)為圓形和橢圓形。2.2.2體積徑的測定在顯微鏡下測量酮康唑微囊的外切徑,轉(zhuǎn)換不同的視野,共觀測計(jì)數(shù)600個(gè)微囊的粒徑,按公式Dv=(Σndt3/Σn)1/3(式中n=個(gè)數(shù),dt=體積徑,取每組段中值,<4μm組段取4μm)計(jì)算得到制備的微囊平均體積徑Dv=(6.82±2.41)μm。2.2.3微囊化率測定精密稱取經(jīng)低溫干燥的酮康唑微囊約0.2g,用1.0%的胰蛋白酶溶液3.0ml,加蒸餾水3.0ml進(jìn)行消化。將盛有樣品的培養(yǎng)皿置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中24h,以0.1mol·L-1鹽酸做為溶媒,在50ml容量瓶中溶解、定容、濾過。取濾液作為供試品溶液,精密量取1ml,以0.1mol·L-1鹽酸稀釋至10ml。在269nm波長處測定其光密度D值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程D=3.1762c1+0.1120(r2=0.9998,n=7,線性范圍0.05～0.15mg·ml-1),得濃度c1,按式c=[(c1×10×50/V)/M]×100%即得百分含量(式中M為稱取微囊的質(zhì)量,V為所取溶液體積)。精密稱取所得酮康唑微囊的質(zhì)量,然后從中精密稱取約0.5g,消化后進(jìn)行含量測定,按式S=c×L/M1×M(式中c為測得的濃度,L為溶液體積,M1為稱取微囊的質(zhì)量,M為該批微囊干燥后的總質(zhì)量)計(jì)算得平均相對包封率為(42.58±1.22)%(n=6)。2.3血藥濃度測定WaterssunfireC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm),柱溫(35±1)℃;流動相為甲醇：磷酸鹽緩沖液(pH4.0)(80：20),流速為1.0ml/min;檢測波長為235nm;進(jìn)樣量20μl。取血漿樣品1ml于一具塞試管中,先加入乙腈1ml,旋渦混合30s,離心后再加入乙腈1ml,旋渦混合30s后離心(3000r·min-1,10min),上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈試管中,于55℃水浴中,氮?dú)饬鞔蹈?加入流動相1.0ml溶解,取20μl進(jìn)樣,記錄峰面積。標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿樣品及用藥后血漿的色譜圖見圖1。在檢測范圍內(nèi)無干擾物質(zhì),本方法具有良好的特異性。按信噪比S/n=3計(jì)算,本方法的最低定量限為20ng·ml-1。在空白兔血漿中加入不同量的KCZ配制成低、中、高(40、600、2000ng·ml-1)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣,按2.3.2項(xiàng)方法操作,每一濃度制備并測定5個(gè)樣品,按上述分別測定日內(nèi)、日間變異,得到RSD<10%。取空白兔血漿1ml共10份,分別加入KCZ配制成20、40、100、200、400、600、800、1000、2000及4000ng·ml-1的系列溶液,按2.3.2方法進(jìn)行測定,記錄峰面積S,然后以S對KCZ濃度c進(jìn)行回歸計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,低濃度段(20～400ng·ml-1)為c=0.0005472S-0.01527(n=5,r2=0.9984),此為S<8000時(shí)的工作曲線;高濃度段(400～4000ng·ml-1)為c=0.0006093S-0.06683(n=5,r2=0.9997),此為S>8000時(shí)的工作曲線?？梢奒CZ在濃度20～4000ng·ml-1范圍內(nèi)線性良好。取家兔15只,隨機(jī)分為3組,禁食24h后,一組口服自制的KCZ微囊1.0g(含KCZ100mg),一組口服市售的里素勞片粉400mg(含KCZ100mg),另一組口服KCZ原料藥100mg,分別于給藥后0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、8、12、24h抽取耳緣靜脈血1ml,于抗凝試管中,按照2.3.2方法測定KCZ血藥濃度,結(jié)果見圖2。數(shù)據(jù)經(jīng)DAS軟件計(jì)算,3種樣品的結(jié)果均以一室模型為宜,其藥動學(xué)參數(shù)見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),KCZ微囊的cmax、t1/2、Ke及藥時(shí)曲線下面積AUC與其他兩個(gè)樣品有顯著性差異(P<0.05)。3家兔體內(nèi)kcz微囊的藥動學(xué)以明膠、阿拉伯膠為囊材,復(fù)凝聚法制備微囊,是將藥物微囊化的經(jīng)典方法之一。將藥物微囊化后,具有掩蓋藥物的不良?xì)馕逗涂谖?、提高藥物的穩(wěn)定性、防止藥物在胃內(nèi)失活或減少對胃的刺激性、使液態(tài)藥物固化便于貯存、減少復(fù)方藥物的配伍變化、緩釋或控釋藥物、使藥物濃集于靶區(qū)以及對生物活性物質(zhì)進(jìn)行包裹使用等特點(diǎn),是近年來受到廣泛關(guān)注的制劑方法之一。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)凝聚法制備酮康唑微囊,方法簡單,產(chǎn)品粒徑均勻,包封率較高。酮康唑微囊的含量測定實(shí)驗(yàn)表明,用單波長紫外分光光度法測定其含量,囊材及輔料基本無干擾,方法簡便,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),成囊率和囊徑的大小與水浴的溫度和滴加鹽酸時(shí)攪拌的速度有密切的關(guān)系,在一定范圍內(nèi)前者與后者成反比。本實(shí)驗(yàn)首次進(jìn)行了KCZ微囊在兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究。結(jié)果表明:采用HPLC法測定血漿中KCZ的濃度方法簡便,檢測靈敏度高,藥物與血漿中雜質(zhì)具有較好的分離度,能滿足體內(nèi)低濃度藥物研究及藥動學(xué)的需要。在處理樣品過程中,乙腈分2次加入用以沉淀蛋白,可避免樣品的損失,提高回收率,而在55℃水溫中用氮?dú)饬鞔蹈伤钑r(shí)間短,有利于KCZ的穩(wěn)定。從KCZ微囊與其原料和片劑的口服給藥后血藥濃度-時(shí)間曲線可以看出,微囊較之于其他兩種制劑血藥濃度更高,藥物利用度也較高,且能在兔體內(nèi)保持更長時(shí)間的有效血藥濃度,達(dá)到了延長作用時(shí)間的要求。從3種制劑的藥動學(xué)參數(shù)可以看出,健康兔口服KCZ微囊后,tmax與片劑相等,而cmax、t1/2和AU