煙草疫霉的生物學(xué)特性及培養(yǎng)

煙草疫霉的生物學(xué)特性及培養(yǎng)

草霉屬重要病原體，具有廣泛的寄主模式，可引起各種作物的生根部位疾病。在我國,其可寄生煙草、大蔥、顛茄、辣椒、柚、甜橙、黃瓜、海島棉、番茄、蘋果、芝麻等。煙草黑脛病(tobaccoblackshank)是由煙草疫霉引起的,是煙草上的重要?dú)缧圆『χ?。煙草疫霉以菌絲體與厚壁孢子隨病株殘體在土壤或堆肥中越冬,成為次年的初侵染源。病株上產(chǎn)生的孢子囊或釋放出來的游動孢子通過地面流水或隨風(fēng)雨進(jìn)行再侵染,侵染主要部位是土表及土面以下5cm深的莖基部。在人工培養(yǎng)條件下,煙草疫霉在相當(dāng)長時間內(nèi)不產(chǎn)生孢子囊或很少產(chǎn)生,即使產(chǎn)生孢子囊,一般也不集中釋放游動孢子。而游動孢子又是重要的侵染形式,因此就影響該病原菌的生理?；汀⑸罍y定以及病害等研究。病原菌接種是研究植物病害、生理小種和生物防治的重要環(huán)節(jié)。而國內(nèi)外報道煙草疫霉的接種方法眾多,標(biāo)準(zhǔn)不一,影響了對該病原菌及其引起的病害的研究。為此,作者對煙草疫霉的產(chǎn)孢和接種方法進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)品種K326,由云南省煙草科學(xué)研究院提供。1.1.2試驗(yàn)中的細(xì)菌煙草疫霉,由本實(shí)驗(yàn)室從重慶市綦江縣所采典型黑脛病煙株中分離所得。1.1.3水、蔗糖、瓊膠的制備燕麥培養(yǎng)基:燕麥30g、蔗糖15g、瓊膠30g、水1000mL;芝麻培養(yǎng)基:芝麻40g、蔗糖15g、瓊膠18g、水1000mL;黑麥培養(yǎng)基:燕麥50g、蔗糖15g、瓊膠18g、水1000mL;PDA:馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊膠18g、水1000mL;PSA:馬鈴薯200g、蔗糖15g、瓊膠18g、水1000mL。1.2方法1.2.1細(xì)沙的覆蓋和培養(yǎng)先把煙草種子于28℃下浸泡1天,再鋪在濕潤濾紙上28℃下催芽,3天后播于裝有濕潤土的瓷盤里,上面再覆一層細(xì)沙,20～26℃溫室中光照培養(yǎng),20天后移栽于裝有沙壤土的塑料缽中,每缽1株,塑料缽的體積為0.21dm3,每10天施1次Hoagland全營養(yǎng)液,10mL/缽。1.2.2燕麥髓片的制備采用髓部碟片分離法,取典型煙草黑脛病病株莖桿,洗凈拭干,蘸95%的酒精,燒干,重復(fù)3次,用滅菌解剖刀剖開,再用滅菌的鑷子夾取碟片置于燕麥培養(yǎng)基平板上28℃培養(yǎng)。3天后純化,保存于燕麥培養(yǎng)基斜面上。致病性測定:調(diào)整孢子囊濃度為1×104個/mL,8℃下處理20min,稀釋10倍后加入1%的葡萄糖,注射8～10葉期煙苗莖基部以上1cm處髓部,每株接種菌液0.1mL,對照注射無菌水。再從接種發(fā)病的植株上分離煙草疫霉,4℃冰箱中保存待用,每6個月回接1次煙草,以恢復(fù)致病力。1.2.3培養(yǎng)基的制備取燕麥培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3天的煙草疫霉邊緣菌絲塊,菌塊直徑0.4cm,分別接種于直徑為9cm的PDA、PSA、燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板中心,每皿培養(yǎng)基量為15mL,28℃溫箱中培養(yǎng),3次重復(fù)。記錄菌絲在平板上生長的時間和測菌落生長量(采用垂直十字交叉法測量菌落直徑,以測得兩值的平均值減去菌塊直徑0.4cm,所得差值除以2即為菌落生長量)。計算平均每天生長量。1.2.4煙草疫霉的誘導(dǎo)處理直接培養(yǎng)產(chǎn)孢試驗(yàn):分別在等量15mL的PSA、PDA、燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板以及含有煙莖皮汁液的燕麥培養(yǎng)基、含有0.1%KNO3的燕麥培養(yǎng)基、含有0.1%Ca(NO3)2的燕麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉,3次重復(fù),28℃溫箱中培養(yǎng),21天后檢測產(chǎn)孢情況。誘導(dǎo)處理產(chǎn)孢:分別在等量15mL的燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上接種活化的煙草疫霉,28℃溫箱中培養(yǎng)14天后,再進(jìn)行各種誘導(dǎo)處理,在燕麥培養(yǎng)基平板上加入0.1%KNO3、0.05%KNO3、0.1%Ca(NO3)2溶液、蒸餾水、煙根際土壤浸出過濾液、滅菌水,燕麥培養(yǎng)基平板光照2h后繼續(xù)培養(yǎng),4℃處理8h后繼續(xù)培養(yǎng),劃破燕麥培養(yǎng)基平板后繼續(xù)培養(yǎng),在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上分別加入0.1%KNO3、滅菌水,分別刮取燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上的菌絲加入0.1%KNO3浸潤。3次重復(fù),6天后檢測產(chǎn)孢情況。三種不同培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子囊釋放率比較:在15mL的燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上分別培養(yǎng)煙草疫霉,3次重復(fù),14天后刮取菌絲,用0.1%KNO3浸潤,5天后測每皿產(chǎn)孢子囊數(shù)量、孢子囊大小及孢子囊釋放率。1.2.5煙草疫霉接種4～6葉期煙苗灌根接種:刮取芝麻培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天的菌絲,加入0.1%KNO3溶液浸潤,產(chǎn)孢后加無菌水搗碎,配成孢子囊濃度分別為1×103、1×104、1×105個/mL孢子懸浮液,8℃下處理20min,稀釋10倍后,加入1%的葡萄糖,接種待用。煙草疫霉接種為灌根接種,接種前用少量清水濕潤土壤,每株接種10mL菌液,灌根。20℃黑暗處理24h,再28℃保持光照(日光燈,4500lx,16h/天),相對濕度80%～90%。對照施等量清水,每處理3次重復(fù),每重復(fù)12株,7天后調(diào)查病情,0級為不發(fā)病,1級為植株死亡。8～10葉期煙苗注射接種:接種菌液同上。煙草疫霉接種方法為注射接種,每株接種0.1mL菌液,注射莖基部以上1cm處髓部,20℃黑暗保濕處理24h,再28℃保持光照(日光燈,4500lx,16h/天),相對濕度80%～90%。對照接種等量的滅菌水,每處理3次重復(fù),每重復(fù)12株。7天后調(diào)查病情。分級標(biāo)準(zhǔn):0級,不發(fā)病,健株;1級,莖、葉有少量病斑,不凋萎;2級,病斑不超過莖圍的1/2,凋萎葉不超過全株葉片的1/2;3級,全株凋萎,但未死亡;4級,全株凋萎,死亡。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基上菌落生長量煙草疫霉在芝麻培養(yǎng)基上生長最快,平均每天菌落生長量達(dá)1.10cm,菌絲豐厚,PDA、PSA上生長最差,平均每天菌落生長量僅為0.46、0.52cm,而且菌絲稀薄,這兩種培養(yǎng)基不適于培養(yǎng)煙草疫霉,在α=0.05和α=0.01水平上,芝麻培養(yǎng)基上菌落生長量與燕麥培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基等相比,都呈顯著差異(表1)。2.2煙草疫霉保鮮液的制備在PDA、PSA、燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板以及含有煙莖皮汁液的燕麥培養(yǎng)基、含有0.1%KNO3的燕麥培養(yǎng)基、含有0.1%Ca(NO3)2的燕麥培養(yǎng)基平板上接種煙草疫霉,直接培養(yǎng)21天后未見產(chǎn)孢子囊,但在加入煙汁、Ca(NO3)2的燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基上菌絲生長良好。2.3kno3培養(yǎng)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草疫霉14天后,進(jìn)行各種誘導(dǎo)處理,其中,只有在燕麥培養(yǎng)基平板加入煙根際土壤浸出過濾液、在芝麻培養(yǎng)基平板和黑麥培養(yǎng)基平板上加入0.1%的KNO3溶液后,產(chǎn)生了孢子囊,但燕麥培養(yǎng)基平板加入煙根際土壤浸出過濾液產(chǎn)孢后污染嚴(yán)重。從燕麥培養(yǎng)基、芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基上刮取菌絲加入0.1%的KNO3浸潤后都產(chǎn)生了孢子囊。在燕麥培養(yǎng)基平板上加入0.1%KNO3、0.05%KNO3、0.1%Ca(NO3)2溶液、蒸餾水、滅菌水,燕麥培養(yǎng)基平板光照2h后繼續(xù)培養(yǎng),4℃處理8h后繼續(xù)培養(yǎng),劃破燕麥培養(yǎng)基平板后繼續(xù)培養(yǎng),在芝麻培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基平板上加入滅菌水,都未產(chǎn)生孢子囊。2.4天麻培養(yǎng)基上所產(chǎn)藥物的產(chǎn)孢能力從三種培養(yǎng)基產(chǎn)孢囊量比較可以看出,在芝麻培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力最強(qiáng),平均為2.52×104個孢子囊/cm2,而在燕麥培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基上分別為2.15×104和2.07×104個孢子囊/cm2,在α=0.05和α=0.01水平上,芝麻培養(yǎng)基上平均產(chǎn)孢量與燕麥培養(yǎng)基、黑麥培養(yǎng)基相比,都呈顯著差異。從孢子囊大小來看,芝麻培養(yǎng)基上所產(chǎn)孢子囊最大,為38.98μm×30.19μm,而燕麥培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基上所產(chǎn)孢子囊較小,大小為26.84μm×23.66μm和29.07μm×25.01μm。從釋放率來看,芝麻培養(yǎng)基上所產(chǎn)孢子囊釋放率最高,為43.0%,而其他兩種分別為28.0%和32.1%(表2)?？偟膩碚f,在芝麻培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子囊較為理想,產(chǎn)孢能力強(qiáng)、孢子囊大、釋放率高。根據(jù)報道,煙草疫霉的致病力強(qiáng)弱與這三種因素緊密相關(guān)。所以在以后盆栽試驗(yàn)以及大田試驗(yàn)中,培養(yǎng)病原菌煙草疫霉可以采用芝麻培養(yǎng)基。2.5煙草疫霉藥物接種后苗高值煙苗接種病情指數(shù)變化4～6葉期煙苗灌根接種和8～10葉期煙苗注射接種都能使煙苗發(fā)病,對照未見發(fā)病,而且重復(fù)性好,這兩種煙草疫霉的接種方法可用于該病原菌及其所引起的病害研究工作中。試驗(yàn)中所用煙草疫霉孢子囊的濃度為1×104時,4～6葉期煙苗灌根接種的病情指數(shù)為69.45,8～10葉期煙苗注射接種的病情指數(shù)為87.23,在α=0.05和α=0.01水平上,注射接種中,較高濃度1×104和1×105個孢子囊/mL之間病情指數(shù)差異不顯著。在α=0.05和α=0.01水平上,灌根接種中三種濃度接種的病情指數(shù)呈顯著差異。較低濃度1×103、1×104個孢子囊/mL接種中,在α=0.05和α=0.01水平上,灌根接種和注射接種相比差異顯著(表3)。3培養(yǎng)煙草疫霉的方法對于煙草疫霉孢子囊的形成和游動孢子的釋放研究,在以前的國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中大都是采用在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲,再加入0.1%KNO3溶液浸潤產(chǎn)孢的方法。Gooding等報道過影響孢子囊的形成和游動孢子活動能力的因素,從燕麥培養(yǎng)基上刮取菌絲加0.1%KNO3浸潤能產(chǎn)生大量孢子囊,游動孢子的濃度越大,游動的時間越長。劉延榮等1983年在人工培養(yǎng)條件下,對影響煙草黑脛病病菌孢子囊的形成和游動孢子釋放的因素進(jìn)行了研究,用低濃度的無機(jī)鹽溶液,如33%Hoagland營養(yǎng)液、0.1%KNO3或蒸餾水浸泡生長旺盛的菌絲,可促使較快形成孢子囊,游動孢子的濃度對游動孢子的游動性影響不大,這與Gooding的結(jié)論不同。楊建卿等在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲,再用加土壤浸出液,可在3天內(nèi)產(chǎn)生大量游動孢子囊,低溫處理后再培養(yǎng)24h,可產(chǎn)生大量游動孢子。Dukes等報道游動孢子產(chǎn)生能力及游動孢子活動能力與毒力呈正相關(guān)關(guān)系,并認(rèn)為Gooding的產(chǎn)孢方法并不穩(wěn)定,重復(fù)性低。其他研究者也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,即燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草疫霉產(chǎn)孢并不穩(wěn)定。在本試驗(yàn)中其產(chǎn)孢也不穩(wěn)定,而且孢子囊較小,釋放率不高。本試驗(yàn)中,芝麻培養(yǎng)基的產(chǎn)孢能力、釋放率都比燕麥培養(yǎng)基高,釋放率高出15.0個百分點(diǎn),而且孢子囊較大。綜合來看,芝麻培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基都可用來培養(yǎng)煙草疫霉產(chǎn)孢,但芝麻培養(yǎng)基產(chǎn)孢能力強(qiáng),所產(chǎn)孢子囊較大,釋放率也較高,這可能與芝麻是煙草疫霉的自然寄主有關(guān),芝麻做成的培養(yǎng)基中含有煙草疫霉生長、產(chǎn)孢的物質(zhì),有利于其生長產(chǎn)孢。關(guān)于煙草疫霉接種方法很多,但這些方法存在著煙草疫霉病原物難量化和方法繁瑣等缺點(diǎn)。John等用莖接種法,先用消毒解剖刀在莖上縱向劃開1cm切口,再用打孔器從供接種用的平面培養(yǎng)物上取下接種體,塞進(jìn)傷口中,或塞入兩粒菌谷,然后封住傷口。根接種方法,先在三角瓶中燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周煙草疫霉,自瓶內(nèi)收集菌絲,加水稀釋,再加入蛭石培養(yǎng)煙苗的缽中,接種4天后,拔出植株,沖洗根系,分級記錄。幼苗接種法,Duke